一种位点重组反向克隆基因方法及其应用<%=id%>

颁证日：
优先权：
申请(专利权)人：华中农业大学
地址： 430070湖北省武汉市洪山区狮子山街
发明 (设计)人：叶志彪;李汉霞
国际申请：
国际公布：
进入国家日期：
专利代理机构：北京路浩专利代理有限公司
代理人：张红兵
摘要
　本发明属于分子生物学领域，与基因技术有关。利用生物的位点特异重组克隆，设计反向杂合特异引物，与带重组克隆的载体系统进行体外定向重组与交换，实现目的基因的反向克隆，获得特异的反义基因克隆载体。这样的载体系统用于基因功能鉴定分析和转基因生物的应用。相比现有技术，它不需对基因片段(或PCR产物)进行限制性的酶切、分离纯化和连接、插入片段的方向分析等操作，是一种快速、便捷、高效的基因克隆到载体系统的新方法。
主权项
　权利要求书 1、一种构建反义基因克隆载体方法，适用于基因沉默研究的基因功能鉴定分析和转基因生物的创造，所指的生物包括植物、微生物和动物，所指的基因为DNA和cDNA的片段或全长，所指的位点特指一段可发生重组和交换的DNA碱基序列，其特征在于，所述的方法包括： (1)引物设计：将15-50 的重组位点attB1的特异序列和目的基因序列的反义链、 15-50 的重组位点attB2的特异序列和目的基因序列的正义链设计成一组PCR引物，然后利用带要入噬菌体的重组位点(attP)元件的质粒载体，进行体外重组克隆； (2)所述的重组克隆元件由attB、attP以及它们重组产生的attL和attR特异位点成对组成，将成对的重组克隆元件装在农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA序列上，通过B×P和L ×R位点之间的重组与交换，获得反向构建的位点特异重组转化载体，并用于遗传转化； (2)通过将重组克隆元件连接在PVX、TRV病毒的核酸载体上，获得反向构建的位点特异重组载体，用于人工接种感染植物； (4)结合PVX和T-DNA的重组克隆元件方法，将连接有重组元件的PVX或TRV一类的病毒载体再连接到如Ti或Ri质粒的转化载体T-DNA上，即可进行稳定的遗传转化和\或可进行感染。

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