高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途<%=id%>

分类号： C12N15/81;C12N1/19;C12N9/36;C12N15/56;A61K38/47;A61P31/00;A61P31/04
颁证日：
优先权：
申请(专利权)人：长春奇龙生物技术研究所
地址： 130022吉林省长春市人民大街179－12号B座13楼3号
发明 (设计)人：安米;张华;李元;安献禄
国际申请：
国际公布：
进入国家日期：
专利代理机构：吉林长春新纪元专利代理有限责任公司
代理人：王薇
摘要
　本发明涉及一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产方法及其新用途。提供了利用提取纯化的基因工程技术表达的人溶菌酶的溶菌活性，用于临床上细菌和真菌的感染，特别是耐药性细菌感染的治疗方法，以及革兰阴性菌感染治疗后内毒素引发的后遗症的治疗方法。提供了用于各种治疗用途的抗生素和人溶菌酶的药用组合物。
主权项
　权利要求书 1、一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途，其特征在于：所述的生产用的材料是：采用毕赤酵母的smd1165(his4.prb1)， smd1163(his.pep4.prb1)，Gs115、km71菌株；其基因工程人溶菌酶的质粒主要是以 IC9k系列的质粒整合在上述菌株染色体上；生产步骤是：1、摇瓶种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸镁)1-5克，K2SO4(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25- 19毫升，MgSO4(硫酸镁)13-17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4-0.8克，K2SO4 (硫酸钾)16-20克，KOH(氢氧化钾)2.12-6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0 -8.0；溶解氧浓度为10-60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸镁)51-55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19-23克， K2SO4(硫酸钾)61-65克，KOH(氢氧化钾)13-17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。提取纯化工艺：将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50 2 万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量和溶菌酶活性； 3

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