一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法<%=id%>

颁证日：
优先权：
申请(专利权)人：暨南大学
地址： 510632广东省广州市暨南大学生物医药研究开发基地
发明 (设计)人：王一飞;罗勇;钱垂文;林锋
国际申请：
国际公布：
进入国家日期：
专利代理机构：广州市红荔专利代理有限公司
代理人：刘兴耿
摘要
　本发明是一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法，涉及纯化工艺流程，填料的选择，以及各纯化步骤的关键技术参数。它包括如下步骤及工艺条件：用低渗冲击法处理样品、硫酸铵沉淀与凝胶过滤、弱阴离子交换层析、亲和层析，最后获得目标蛋白纯品。所获蛋白纯度高达98％以上、得率高达47％以上、工艺操作简单、整个流程耗时少，凝胶柱、亲和柱使用寿命长等为本发明之优点。
主权项
　权利要求书 1、一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤及工艺条件：步骤一用低渗冲击法处理样品将发酵后所获菌体用15～30％蔗糖溶解、0～6℃下放置10～60min，在低温 -10～4℃下高速离心5000～20000rpm10～60min，去上清，加入5～15mmol/L的磷酸缓冲液溶解，于0～6℃下放置10～60min，在低温-10～4℃下高速离心 5000～20000rpm10～60min获取上清；步骤二硫酸铵沉淀，凝胶过滤将步骤一所获得的上清中逐步加入硫酸铵晶体至硫酸铵浓度达10～50％，在 0～10℃下离心5000～20000rpm10～60min得蛋白沉淀，用由20mmol/L Tris-HCLpH7.5、1mmol/L EDTA Ph7.5、2mmol/L Mgcl2pH7.5、1mmol/L DTTpH7.5 组成的缓冲液A将蛋白质完全溶解，将溶解后的液体用凝胶填料装填柱过滤，柱型为3.5×90cm的柱子，上样量为10～100ml重新溶解的蛋白溶液，洗脱线速度3～30cm/h，收集各个洗脱峰液，通过SDS-PAGE确定目标蛋白洗脱峰液，目标蛋白带的分子量为17KD左右；步骤三弱阴离子交换层析将步骤二收集的目标蛋白洗脱峰液体经柱型为5×20cm采用DEAG弱阴离子填料装填的离子柱层析，先用缓冲液A平衡柱子后，上样量为30～200ml经步骤二凝胶过滤后收集的目标蛋白洗脱峰液，洗脱线速度为3～30cm/h，上样完毕后以0.08～0.14mol/L Nacl+缓冲液A、0.17～0.22mol/L Nacl+缓冲液A、 0.5～1.0mol/L Nacl+缓冲液A依次进行梯度洗脱，洗脱速度为4～30cm/h，收集 0.17～0.22M Nacl+缓冲液A的洗脱峰液，此即为目标蛋白洗脱峰液；步骤四亲和层析柱型5×12cm、填料为一种蓝色颜料Cibacron Blue-3GA，用缓冲液A平衡柱子后上样50～500ml经步骤三收集的目标蛋白洗脱峰液体，用0.17～0.22mol/L Nacl+缓冲液A洗脱至基线，换用0.17～0.22mol/L Nacl+缓冲液A+0.5～3mmol/L ATP的洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰液，洗脱峰溶液脱盐后经冷冻干燥，即可得蛋白干粉。

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