|
了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导细胞融合的方法。
细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上 的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。 人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速 成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融 合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也 能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用 于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域， 并且取得显著的成绩。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可 用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂 类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜 的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视 野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总 数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是： 用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
***材料：蟾蜍血红细胞，鸡血红细胞。
牛蛙
蟾蜍
公鸡
***试剂：
(1)Alsver液：葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠 0.8 g，氯化钠0.42 g，用柠檬酸溶液调节pH值至7.2,最后用重蒸水定容至100 mL 即可。
(2)0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于 100mL重蒸水中。
(3)GKN液：氯化钠8 g，氯化钾0.4 g， 磷酸氢二钠1.77g，磷酸二氢钠0.69g，葡萄糖2 g，酚红0.01 g，溶于1000mL重蒸水中。
(4)Ringer溶液：氯化钙0.25g，氯化钾 0.42g，氯化钠6.5g(恒温动物8.5g)溶于1000mL蒸馏水中。
(5)氯化钙0.14g ,氯化钾 0.4g , 磷酸二氢钾0.06g ,氯化镁0.10g , 氯化钠8.0g ,碳酸氢钠0.35g , 七水磷酸氢二钠0.09g ,D-葡萄糖1.0g,酚红0.01g
(6)50％PEG混合液：称取少许PEG(Mw 4000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃ 的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。
***仪器：显微镜，离心机，水浴箱，电炉， 量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯， 吸管，载玻片，盖玻片，显微镜。
1.细胞悬液的制备： (1)蟾蜍血红细胞悬液的制备：用注射器吸入1mL Alsver液后，从蟾蜍主动脉弓取血1mL 放入刻度试管中，再加入2mLAlsver液(封口 后可4℃冰箱内可保存1周)；放入刻度离心 管内，按照3：1(V／V)加入6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。 (2)鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V／V)加入6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。
2.取细胞悬液1mL，移人10mL离心管， 加入4mL0.85％生理盐水混匀。1500r／min离心5 min。
3.弃上清液(用吸管吸去)，加0.85％生理 盐水至5mL，混匀后1500r／min离心5min。
4.重复上述条件，再离心洗涤1次。
5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入 适量的GKN液或Ringer溶液，按压积红细胞体积配成10％的红细胞悬液。 '
6.取悬液1mL到1个试管中，加入0.5～0.8 mL预热的50％PEG混匀，置于37℃水浴中温浴2min； 再加入Ringer或Hanks液5ml以终止PEG的作用;取血细胞悬液1滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,盖上盖玻片。
7.利用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2个靠近细胞或3个细胞形成融合的过程。
8.进行多个视野的测定，统计平均融合率。
 （点击下面的链接查看图片,如果你禁止了弹出窗口,你将无法看到结果图片或视频!）
鸡红细胞融合图
1、绘制观察到的细胞融合图。
2、计算观察到的细胞融合率。
如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行灭菌，采血在无菌条件下进行。
|
