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1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后 为原生质所包围的“*细胞”,是开展基础研 究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维 素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除 去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须 保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。 其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双 醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
***材料：绿豆,烟草幼苗叶片等。
绿豆
烟草幼苗
***试剂：
(1)酶解液(绿豆)：1%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。
(2)13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4,101.0mg/L KNO3,1480.0mg/LCaCl2.2H2O,246.0mg/L MgSO4,0.16mg/L KI ,0.025mg/L CuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH 6.0。
(3)酶解液(烟草)：用01％2-N-吗啡 啉乙磺酸钠配制2％(W／V)纤维素酶,1％ (W／V)果胶酶,005 mmol／L氯化钙,0.6 mol／L甘露醇,pH 6.0。
(4)洗涤液(烟草)：0.2 mol／L氯化钙, 加有01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠,pH 6.0。
(5)0.1％2-N-吗啡啉乙磺酸钠或三羟 甲基氨基甲烷溶液：内含20％蔗糖,pH6.0。
(6)0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用 时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。
(7)20%蔗糖溶液
(8)无菌蒸馏水。
***仪器：摇床,离心机,倒置显微镜,普通显微镜,超净工作台,培养皿,离心管,载玻 片,刀片,镊子,过滤漏斗,200目筛网,吸 管,高压蒸汽消毒锅,镊子,解剖刀。
1. 绿豆幼苗下胚轴：
(1)绿豆种子用70%乙醇消毒,自来水流 水浸泡4h左右,于湿滤纸上萌发。25℃黑暗中培养约60h。取幼苗下胚轴或根为材料进行分离原生质体。
(2)取黄化幼苗下胚轴2～3g,从弯钩下3mm处 向下切取约5mm的切段,切成0.5mm的薄片置于10 ml酶解液中(也可以取1 cm左右的绿豆幼苗的根尖作为实验材料,直接置于酶解液中)。置于摇床上,25～28℃,60～70r/min,酶解6～7h。
(3)用200目筛网过滤酶解液(制一张装片,观察),滤液经 1000rpm离心5min,弃去上清液。
(4)用3～4ml13%CPW液洗涤并溶解沉淀,悬液经1000rpm离心5min,留1ml上清液,其余弃之。
(5)取10ml离心管1支,注入3ml20%～25%蔗糖,将沉淀的原生质体悬浮,用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖 溶液上,1000rpm离心5～8min,将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中，沉淀制一张装片,观察。
(6)用13% CPW液洗涤1～2次,每次1000rpm离心5min,得到较为纯净的原 生质体。用13% CPW液悬浮至一定密度并制一张装片,观察。
(7)取1滴原生质体提取液在载玻片上,加入相同体积的0.02%FDA稀释液,静置2min 后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。
2.烟草幼苗叶片：
(1)取充分展开的叶片,用自来水冲洗干净。
(2)在超静工作台上,叶片用0.1％升汞溶 液中浸泡灭菌10min(中间摇动几次)。取出叶片,无菌蒸馏水漂洗5次。
(3)将叶片放入大培养皿中,吸去水分,叶背面朝上,用无菌镊子小心撕去下表皮,或用解剖刀将叶片切成0.5mm宽的小条。
(4)另取1个培养皿或带盖的三角瓶,加入酶解液10mL,放叶片约2g,浸泡。
(5)在28C保温3～6h,中间轻轻摇动2—3次。
(6)用200目筛网过滤酶解液,滤液经 600×g离心5min,使原生质体沉淀下来。
(7)用移液管吸去上清液,将沉淀的原生质体悬浮在0.2mol／L CaCl2·2H20 2mL中。
(8)用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入20％蔗糖6mL,在600×g离心5min。 这时,在两相溶液的界面之间出现一层纯净的完整原生质体,杂质和碎片都沉到管底。
(9)取原生质体提取液1滴于载玻片上,加入相同体积的 0.02％FDA稀释液,静置5 min 后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。
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植物原生质体分离和活性鉴定
分别述说你观察到的三张临时装片的结果,你认为此种分离与纯化原生质体的方法如何,有无可改进或优化之处？
1.你认为要获得数量多、生活力强的原生 质体,在实验中应注意那些问题?
2.除了本实验介绍的方法,还可以用哪些 方法判断分离的原生质体活力?
(王小菁李玲)
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