|
1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
2.掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法
利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。（差速离心技术）
线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。
细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。
Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。
***材料： 鼠肝脏, 猪肝脏
***试剂：
(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)
0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液10ml
0.1mol/L盐酸8.4ml
加双蒸水到100ml,再加蔗糖使浓度为0.2mol/L
(2) 0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）,配法同上。
(3) 1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液,称取50mg（pH7.4）,詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中,稍微加热使之溶解后,过滤,即为1%原液。
(4) 姬姆萨染液（Giemsa）：称取姬姆萨粉0.5g,甘油33 ml 、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量，用1/5mol/L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。
(5) 1/15 mol/L磷酸缓冲液?（pH6.8）
1/15 mol/ L磷酸二氢钾 (KH2PO4)50 ml
1/15 mol/ L磷酸氢二钠（Na2HPO4） 50 ml
(6)卡诺（Cornay）固定液：无水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml
(7)生理盐水
***仪器：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。
1.制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0℃~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，,肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制一张涂片①,自然干燥).
2.差速离心：将0.34 mol/ L 蔗糖溶液4.5 ml放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5 ml鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差 速离心。
分离细胞核
鼠肝1克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液（制涂片一张①）
↓
将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
700×g离心10min
↓
↓ ↓
沉淀（细胞核及碎片） 上清液1(制一张涂片②,自然干燥)
↓
洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶
液5mL洗涤两次）每次1000×g
离心15min
↓
↓ ↓
沉淀（细胞核） 上清液2(与上清液1合并)
分离线粒体
混合上清液10000×g离心10
↓
↓ ↓
沉淀（线粒体） 上清液（弃去）
↓
洗涤，加 0.25mol/L预冷
蔗糖溶液10mL ,10000×g离心
10min,重复洗涤两次
↓
↓ ↓
沉淀（线粒体） 上清液（制一张涂片③后弃去）
3.分离物鉴定：
（1） 细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40×）检查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片.
（2） 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
 （点击下面的链接查看图片,如果你禁止了弹出窗口,你将无法看到结果图片或视频!）
鼠肝细胞核图片
1.分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2.描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的纯度如何?
1.试验全过程要在0～4℃进行，如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。
2.g为离心力，与rpm/min关系见于常用数据。
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？
2. 要获得高活性的线粒体在线粒体提取，分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？
|
