盐析法纯化免疫球蛋白

液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。　　(5)　0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:　　将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。　　(6)　20％磺基水杨酸。　　2.　器材:　　普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。　　透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。　　烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。(三)　盐析的操作步骤　　　取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与　　　稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50％饱和(NH4)2SO4]　　　　　　　　　　　↓4℃，3小时以上，使其充分沉淀　　　离心(3000rpm), 20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。　　　再逐滴加饱和硫酸铵Ｘ/２ml　　　　　　　　　　　↓置4℃，3小时以上［此时(NH4）2SO4的饱和度为33％)］　　　重复上述第二步过程1?次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M 　　　PH7.4 PBS溶解至Xml装入透析袋。　　　　　　　　　　　│对PBS充分透析、除盐换液3次，　　　　　　　　　　　↓至萘氏试剂测透析外液为无-　　　将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。　　　方法如下:　　　　　蛋白含量(mg／ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。　　　　　注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。(四)　影响盐析的因素　　1.　蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。　　2.　离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。　　3.　盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。　　4.　PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。　　5.　温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。　　6.　蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
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