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含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低，一般采用含水量10-20%的硅胶。 用硅胶进行色谱分离时，要提前进行活化和纯化。纯化即降低硅胶活性，实验表明，硅胶加入4-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。活化是指在150-195℃加热硅胶，活化覆盖有第一层小分子的硅胶，提高硅胶对样品溶质的吸附能力，其缺点是导致硅胶极性上升，产生催化反应或不可逆吸附。 此外常用的还有：1）氧化铝 分为碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝，其吸附活性与含水量关系很大，在一定温度下除去水分可使氧化铝活化；2）活性炭 分为粉末活性炭、颗粒活性炭和锦纶活性炭，其吸附能力在水溶液中最强，使用前一般在150℃加热4-5小时，将吸附的大部分气体除去，锦纶活性炭则在100℃以下进行。3）聚酰胺 国外称尼龙，国内称锦纶，特别适合低分子量化合物的分离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌几芳香族化合物等。4）聚苯乙烯吸附剂 5）磷酸钙 在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一适用于生物活性高分子物质分离的吸附剂，主要用于蛋白质的色谱分离、也适用于较小分子的核酸如转运RNA。 三．吸附柱色谱的实验技术 1． 吸附剂的选择及处理 吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙，有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说，所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力：对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀。 吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒（100-200目），对含有杂质的吸附剂可用有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡处理或提取除去，有些吸附剂可用沸水洗去酸碱使呈中性，有些需经加热处理活化。 2. 溶剂与洗脱剂 两者常为同一组分,但用途不同。习惯上把用于溶解样品的溶液称为溶剂，把用于洗脱洗脱柱的溶液称洗脱剂。原则上所选的溶剂和洗脱剂要求纯度高，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，易流动，易与洗脱的组分分开。常用的溶剂和洗脱剂有饱和碳氢化合物、醇、酚、醚、卤化烷、有机酸等。 3． 柱的装填和样品的加入 色谱柱一般为玻璃或有机玻璃管制成，柱下端装上一块2-4号烧结玻璃或垫一层玻璃丝以支持吸附剂，管内装吸附剂。有条件可附加压或减压装置，使流速保持恒定，色谱柱外也可配恒温管套。 装柱的方法通常是将一种在适当溶剂中的吸附剂调成糊状，慢慢地倒入关闭了出水口的柱中，同时不断搅拌上层糊状物，赶去气泡，并使装填物均匀的自然下降，装置所需要的高度后，打开出水口，让溶剂流出。注意柱的任何部分不能流干，即是说、再柱的表面始终保持着一层溶剂。 小心地用移液管把样品液绕柱内壁小心地加入，不要冲击着吸附剂的表面。加样的另一个办法是用一个注射器和蠕动泵把样品直接送到柱表面上。 3. 洗脱 在整个洗脱过程中，要使洗脱液通过柱时保持恒定的流速，可以用调节"操作压"来调控（操作压相当于在柱上面的贮液瓶中溶剂的水平和柱出口位置的水平之差）。另一个方法是时用蠕动泵。 洗脱过程中柱内不断发生溶解（解吸），吸附，在溶解，在吸附。被吸附的物质被溶剂解吸，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂又把该物质自溶剂中吸附出来，后来流下的新溶剂又在使该物质溶解而向下移动。如此反复解析，吸附，经过一段时间后，该物质向下移动至一定距离，此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及溶剂对该物质的溶解能力有关，分子结构不同的物质溶解度和吸附能力不同，移动距离也不同,吸附较弱的就易溶解，移动距离较大。经过适当时间后，各物质就形成了各种区带,，每一区带可能是一种纯物质，如果被分离物质是有色的，就可以清楚地看到色层。随着洗脱剂向下移动，最后各组份按吸附力的不同顺序流出色谱柱，以流出体积对浓度作图，可得由一系列峰组成的曲线，每一峰可能相当于一个组分。 第二节 离子交换色谱法 离子交换作用是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里,溶液称流动相，而固体称固定相. 一. 离子交换剂的类型 1． 聚苯乙烯阳离子和阴离子交换树脂 这是最重要一类离子交换树脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，在引入所需要的酸性基或碱性基而成。根据引入的可离解基团的性质又可分为下列两类离子交换树脂： 1)聚苯乙烯阳离子交换树脂 这类交换剂可再分为强酸型、中强酸型及弱酸性三种；2）聚苯乙烯阴离子交换树脂 也可在分为强酸性、中强酸性及弱酸性三类。 2． 聚丙烯酸阳离子交换树脂 是由甲基丙烯酸和二乙烯的聚合而成。这类树脂具高度的交换量，每棵树脂可交换10毫克当量物质。这种高度缔合的非离子化羧基使树脂的表面形成一个亲水平，对极性分子能起一种很有效的吸附作用。 3． 其它离子交换剂 1）选择性离子交换剂 是利用某些特殊的有机溶剂可与某些金属离子起选择性反应的原理而制备的。如用含汞的树脂分离含巯基的化合物（辅酶A，半胱氨酸，谷胱甘肽）。 2）吸附树脂 是一类有很大的表面积，吸附能力强，离子交换的能力很小的树脂。主要用于脱色和除去蛋白质等，也成为"脱色树脂"。 3）电子交换树脂 这类所交换的不是离子而是电子，交换反应是个氧化还原反应，也称"氧化还原树脂"。 由于上述几种离子交换剂与生化物质的分离制备关系不大，这里不作详细介绍。 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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