PCR技术（十一）：PCR片段拼接的SOE和SDL方法

SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：　　（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸，产生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关，而是由切点附近的序列决定的。　　（2）扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5链引物包括常规5 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3链引物包括常规3链引物和AC及EcoRI 识别位点。　　（3）唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。　　（4）把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺序依次拼接。　　显而易见，在SOE法中，退火时的最希望产物是AD，杂交链，但A链和B链，C链和D链配对的可能性更大，另外还有B、C链的配对，这些都是不利的；而SDL法中就不存在这个问题。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在复制中可能带来的错误，所以，SDL法更优越。
< 1 > < 2 >

设为首页 | 加入收藏 | 广告服务 | 友情链接 | 版权申明