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核酸电泳的指示剂与染色剂 1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DN-段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便. 染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察. 银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳 1.电泳装置: 电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法: (1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子. (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DN-段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳. 3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固. 4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有 气泡，应设法除去. 5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内. 6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算). 7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可. (3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DN-段和DNA序列分 析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～1001245 *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料 1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件. 2.30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 装于棕色瓶内，4℃可保存二个月. 3.10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克 加水至，10ml 4℃可保存一周，-20℃可保存一个月. 4.1XTBE电泳缓冲液 5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 根据分离DN-段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶. 1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出. 2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角. 3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数. 4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止. 5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10°角，可减少液体泄漏的机会. 6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液. 7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则. 8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡. 9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳. 10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳. 11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果. 12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.
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