在质粒载体中进行平末端片段的克隆

在质粒载体中进行平末端片段的克隆 1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DN*段，使它们能产生平末端。2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DN*段。3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。4．将载体DNA去磷酸化。5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管：管号DNAA和E载体1 [60fmol (~100ng)]B外源插入片段2[60fmol (~10ng)]C和F载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）D线状载体（5’-磷酸化）（60fmol）G环状载体[60fmol (~10ng)]1 载体DNA已进行去磷酸化2 外源目的DNA可以连接接头。3 连接反应中，质粒载体和插入的DN*段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。 a. A、B和C管中加入： 10×连接缓冲液 1.0μl T4噬菌体连接酶
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