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p; 1μl1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl1mol/L KCl 3.5μl250 mmol/L MgCl2 2μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用） 25单位加H2O至 48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）： [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2：cDNA第二链的合成]1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：10 mmol/L MgCl2 70μl2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μlRNase H (1000单位/ml) 1μl大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：β-NAD (50 mmol/L) 1μl大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl室温温育15min。3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。4．取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。5．将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。6．将下列试剂加到DNA溶液中：10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μlT4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl室温温育15分钟。7．测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法测定1μl第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。8．用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二链合成量/μgx表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的70~80%9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。11． 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。12． 用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。13． 小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。14． 如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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