PCR的问题与优化

短复性时间或增加复性温度。扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带。要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板DNA过量。检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。应用降落PCR和（或）热启动PCR。降低模板DNA的量。对可能发生在PCR过程中的主要问题的解析表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。表2 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法症状可能原因补救措施扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。复性条件不是最合适的。重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。被复性结合到模板上的引物不适合延伸。优化MgCl2、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Cheng et al. 1994）。应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。重新纯化模板DNA以去除抑制物。在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5% PEG6000或10%甘油）。如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。变性不完全。增加变性的时间或者设置更高的变性温度。两个引物之间的距离太大。应用那些能够扩增大DN-段的热稳定DNA聚合酶。多种扩增产物条带应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。引物二聚体过量应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（booster PCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。
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