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nbsp; 4μlDTT（40mmol/L） 0.5μlNTP混合液（用于H－RNA或X－RNA） 2μlRNA酶抑制剂 0.5μl（约15单位）H2O 对H－RNA加8.5μl或对X－RNA加2.5μl为避免DNA的亚精胺沉淀，须在室温或37℃加各种试剂。 注：H－RNA 用于体外加工测试；X－RNA 用于UV交联测试NTP混合液（H－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP 0.25mmol/L UTPNTP混合液（X－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP2．向反应液中加入2μl（对H-RNA）或8μl（对X-RNA）α-[32P]UTP。3．加0.5～1μl（即10～20单位）SP6，T3或T7聚合酶使反应终体积为20～20.5μl。4．37℃温育40～60分钟。5．加入15μl 5mol/L乙酸胺和100μl 100％乙醇沉淀RNA。6．－20℃放置10分钟，4℃离心10分钟。7．弃上清，空气和真空干燥RNA沉淀，用7μl甲酰胺染液重悬RNA。8．在沸水中将RNA重悬液煮3分钟后，于冰上快速冷却，加样于6％的变性丙稀酰胺凝胶。9．用Saran®膜包上凝胶，对X光片曝光约20秒。10． 切下含有RNA的凝胶片放入1.5ml微量离心管中。11． 在该离心管中加入：DEPC处理过的水 180μlDEPC处理过的乙酸钠（3mol/L, pH5.5） 20μlDEPC处理过的EDTA（0.25mol/L） 1μlSDS（20％） 1μl12． 在65℃温育1～1.5小时或40℃下过夜使RNA从凝胶中扩散出来。13． 将RNA液转移入新的微量离心管中，加入500μl 100％乙醇，－20℃放置10分钟。计数契仑科夫辐射。14． 离心10分钟沉淀RNA，弃去上清，真空下干燥沉淀，在进入下一操作前用合适的缓冲液重悬RNA。
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