差异显示法

差异显示法[原理]：该实验方法是针对从特定细胞或组织类型的mRNA池来源的样品用PCR技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法。该实验方法倚赖两套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。锚定反义引物是与mRNA的poly(A)尾及3’-非翻译区的连接处相复性结合。正义引物是一种10-mer的随机引物，将锚定引物与随机引物加入反应混合液，用PCR技术进行双链cDNA产物的扩增。通过比较两种不同细胞类型或在不同生长条件下同种细胞类型来源的扩增cDNA产物的电泳带谱，能够用于鉴定其表达基因图谱的差异。方法：[优化DNA浓度：cDNA第一链的制备]1．用几支0.5 ml离心管，设立实验反应管系列，建立对照管和实验管的RNA最佳浓度。用水对RNA样品进行5倍连续稀释系列，产生RNA样品浓度范围在1μl/ml与100μg/ml之间系列。2．从锚定3’-寡核苷酸引物库中选择一个或更多的引物，设立不同的稀释RNA模板量的复性反应系列：RNA模板 8.0μl，锚定3’-寡核苷酸引物2.0μl。反应管在65℃水浴上温育10 min，然后放置在37℃水浴上。3．加入复性反应试剂：5×DD-PCR反转录缓冲液 4μl100 mmol/L DDT &nbs
< 1 > < 2 >

设为首页 | 加入收藏 | 广告服务 | 友情链接 | 版权申明