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实验频道正文 用户登录 新用户注册 真核细胞DNA的制备与定量 作者：佚名 实验频道来源：生物谷 点击数： 更新时间：2004-6-18 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。⑷ 60°C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。⑷ 50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测： 取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。 处理 SSI 文件时出错 处理 SSI 文件时出错 【评论】【进论坛看】【转入博客】 实验频道录入：生物编辑 责任编辑：生物编辑 上一篇实验频道： 寡核苷酸的优化设计 下一篇实验频道： 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 【发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口】 相关文章 最新热门 推荐文章 常见园艺植物组织培养培养基常用溶液的配制2%多聚甲醛固定剂配方二则细胞学技术细胞培养的一般技术血小板的活化、荧光染色与流血小板活化检测方法细胞表面抗原染色的组织样本流式细胞仪PI染色死细胞方法流式细胞术分析血小板 · 免疫细胞表面抗原分子CD家族对照表· 所有的看家基因(housekeeping gene· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册· RNAi和基因沉默的历史回顾· RNAi原理图解· RNAi术语表· siRNA设计指南· Methods for DNA sequencing · 通用电气医疗集团简介· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· RNA干扰技术获得新突破· 蛋白质特性与分离纯化技术的选择· PCR实验指导与常见问题分析· RNAi原理FLASH演示· Extrachromosomal elements, plasm· Promoter analysis by saturation · 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册 文章评论 （只显示最新10条。评论内容只代表网友观点，与本站立场无关！） 生物谷 | 网站介绍 | 网站地图 | 广告服务 | 帮助 关于我们 | 广告服务 | 战略伙伴 | 留言| 帮助信息| 联系方式 | 客户投诉 | 友情链接 | 网站地图 | 网站声明 | Bioon English 上海北岸信息技术有限公司 公司地址：上海龙吴路51号嘉源商务中心1#211室(200232) 生物谷网站 bioon.com © Copyright 2001 - 2006. All rights reserved. 备案号：沪ICP备05022939号
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