表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析-实验方法

实验频道正文用户登录新用户注册表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析作者：佚名实验频道来源：生物谷点击数：更新时间：2004-6-18 一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。5、10´电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。7、2´SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%)的配制: ddH2O 4.0ml 30%储备胶 3.3ml 1.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% AP 0.1ml 取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制： ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml TEMED 2 μl 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。（三）电泳:在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。处理 SSI 文件时出错处理 SSI 文件时出错【评论】【进论坛看】【转入博客】实验频道录入：生物编辑责任编辑：生物编辑上一篇实验频道：原核表达下一篇实验频道： Western免疫印迹【发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口】相关文章最新热门推荐文章常见园艺植物组织培养培养基常用溶液的配制2%多聚甲醛固定剂配方二则细胞学技术细胞培养的一般技术血小板的活化、荧光染色与流血小板活化检测方法细胞表面抗原染色的组织样本流式细胞仪PI染色死细胞方法流式细胞术分析血小板 · 免疫细胞表面抗原分子CD家族对照表· 所有的看家基因(housekeeping gene· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册· RNAi和基因沉默的历史回顾· RNAi原理图解· RNAi术语表· siRNA设计指南· Methods for DNA sequencing · 通用电气医疗集团简介· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· RNA干扰技术获得新突破· 蛋白质特性与分离纯化技术的选择· PCR实验指导与常见问题分析· RNAi原理FLASH演示· Extrachromosomal elements, plasm· Promoter analysis by saturation · 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册文章评论（只显示最新10条。评论内容只代表网友观点，与本站立场无关！）生物谷 | 网站介绍 | 网站地图 | 广告服务 | 帮助关于我们 | 广告服务 | 战略伙伴 | 留言| 帮助信息| 联系方式 | 客户投诉 | 友情链接 | 网站地图 | 网站声明 | Bioon English 上海北岸信息技术有限公司公司地址：上海龙吴路51号嘉源商务中心1#211室(200232) 生物谷网站 bioon.com © Copyright 2001 - 2006. All rights reserved. 备案号：沪ICP备05022939号
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