组织和细胞RNA的制备-实验方法

实验频道正文用户登录新用户注册组织和细胞RNA的制备作者：佚名实验频道来源：生物谷点击数：更新时间：2004-6-18 一、组织和细胞总RNA提取：异硫氰酸胍法（一）试剂准备 1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2 mM β-巯基乙醇。 2．变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。 3．2 M乙酸钠：pH 4.0。 4．异丙醇 5．无水乙醇、70%乙醇 6．酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）7．DEPC H2O：100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。（二）操作步骤 1．样品处理：（１）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。（２）组织：取1-2g组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。2．加2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。4．4℃离心，12000g×20min。5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。7．4℃离心，12000g×15min。8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃水浴促溶）。9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。10. 4℃离心，12000g×15min。11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。12. 弃上清，将沉淀晾干。13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。（三）注意事项：1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。TRIzol法TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。（一）试剂准备1． TRIzol试剂。2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC H2O配制）5．DEPC H2O（二）操作步骤1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。二、总RNA定量 RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000 RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。处理 SSI 文件时出错处理 SSI 文件时出错【评论】【进论坛看】【转入博客】实验频道录入：生物编辑责任编辑：生物编辑上一篇实验频道： RNA操作中的一般要求下一篇实验频道： mRNA的分离与纯化【发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口】相关文章最新热门推荐文章离心机转数与离心力的换算ATP的生成、储存和利用细胞生长的ATP检测[荧光素酶上皮细胞培养血管内皮细胞原代培养细胞培养中的一些试剂神经胶质细胞培养细胞培养染色体显示原代神经细胞培养实验方法肌组织细胞培养 · 免疫细胞表面抗原分子CD家族对照表· 所有的看家基因(housekeeping gene· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册· RNAi和基因沉默的历史回顾· RNAi原理图解· RNAi术语表· siRNA设计指南· Methods for DNA sequencing · 通用电气医疗集团简介· 生物发光与化学发光专题· 生物发光和化学发光在生物技术中的· RNA干扰技术获得新突破· 蛋白质特性与分离纯化技术的选择· PCR实验指导与常见问题分析· RNAi原理FLASH演示· Extrachromosomal elements, plasm· Promoter analysis by saturation · 重组DNA的分离、克隆与测序实验手册文章评论（只显示最新10条。评论内容只代表网友观点，与本站立场无关！）生物谷 | 网站介绍 | 网站地图 | 广告服务 | 帮助关于我们 | 广告服务 | 战略伙伴 | 留言| 帮助信息| 联系方式 | 客户投诉 | 友情链接 | 网站地图 | 网站声明 | Bioon English 上海北岸信息技术有限公司公司地址：上海龙吴路51号嘉源商务中心1#211室(200232) 生物谷网站 bioon.com © Copyright 2001 - 2006. All rights reserved. 备案号：沪ICP备05022939号
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