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    限制性内切酶质量控制

     单位定义 限制性内切酶的一个活性单位是指,在50μl 的反应体系里,采用随酶提供的 NEBuffer,用1个小时的时间,彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。 酶切反应应在带盖的Eppendorf 管中进行,选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前,浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml。 质量控制 所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。 非特异性内切酶鉴定 为鉴定非特异性内切酶污染,限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋DNA底物温育。对于RF I型DNA(超螺旋形式),一个单一的非特异性缺口就会将它转变成RF II型DNA(带缺口环状)。小份的限制性内切酶与1μgDNA在50μl反应体系中,采用推荐的NEBuffer,在推荐的温度下温育4小时。两种形式的DNA在琼脂糖凝胶上很容易区分,可以计算出从RF I 到 RF II的转化率。 核酸酶污染的过夜鉴定 所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中,采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变,则说明测试的酶中不存在非特异性的DNA酶。我们报道了可以温育过夜的最大酶单位数。 核酸外切酶污染鉴定 所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA (200,000
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