限制性内切酶质量控制

cpm/μg)在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。 DN-段的连接 DN-段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′ 末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′ 和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生；而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′ 和 5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一个例子显示如下：蓝白斑筛选鉴定用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点，连接，转化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基因产生蓝斑，一个不完整的基因(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3％。
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