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反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序加大酶量5-10倍DN-段数目多于理伦值1) 内切酶星状活性检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2) 其它内切酶污染用λDNA作底物检查酶切结果3) 底物中含其它DNA杂质电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DN-段酶切后没有观察到DN-段的存在1) DNA定量错误（如RNA含量较高）用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次内切酶保存期内快速失活1) 保存温度不合适内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存2) 以稀释形式保存稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3) 贮藏缓冲液不适当使用厂家推荐的贮藏缓冲液4) 低蛋白浓度内切酶与500ug/ml的BSA一起保存电泳后DN-段的带型弥散，不均一1) DNA上结合有蛋白质电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化2) 内切酶中含有DNA外切酶减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶酶切后的DN-段连接效率低1) 含磷酸盐的浓度高透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2) 内切酶失活不全或含有ATP酶延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端连接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA5) 连接缓冲液不合适重新配制连接缓冲液三、DNA分子量标准问题分析：问题原因解决办法带弱或无DNA带1) 上样DNA的量不够增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4) 对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度DNA带缺失1) 小DNA带走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2) 分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3) DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4) 巨大DNA链，凝胶电泳不合适在脉冲电声凝胶电泳上分析DNA带模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量3) 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐5) 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白6) DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA不规则DNA带迁移1) 对于λ/Hind III片段COS位点复性电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力3) DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDN-段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DN-段形成正常的带型分布。四、凝胶电泳操作注意事项： 1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
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