Accelrys软件在测定生物大分子结构中的应用

来结构生物学中最主要的热点，涉及数学、物理、化学、信息科学与生命科学多学科的交叉，蛋白质科学与技术逐步成为本世纪生命科学领域中争夺最激烈的前沿。2000年9月，美国NIGMS投入数亿美元，在美国建立7个研究中心，目标是在未来10年内解出1万个蛋白质的三维结构，建立蛋白质的氨基酸残基序列、三维结构和生物功能之间的有机联系。日本在2002年大约有20个实验室参与蛋白质结构研究工作，一个大规模的核磁实验室已在日本建成，配置6台800 MHz NMR谱仪、4台900 MHz NMR谱仪和10台600 MHz NMR谱仪，还将扩展到40 台谱仪。　　计算机硬件和软件的迅猛发展和图像显示技术的进步都一直在为结构分子生物学的发展提供着机会和条件。先进的软件技术的发展也不断的为X射线单晶衍射及核磁共振方法的研究提供更先进的手段，他们将会为结构分子生物学研究手段的发展带来更大的推动。Accelrys公司的软件在X射线晶体衍射和核磁共振方法测定生物大分子结构的研究中有着广泛的应用。X射线晶体衍射技术中的应用　　X光晶体衍射技术是寻找最优晶体生长条件、使用超细聚焦、高能量光源和低温设备，收集衍射数据，确定相位问题，获得蛋白质的空间结构。蛋白质晶体结构分析主要包括下列几个步骤：1.蛋白质晶体培养。结构测定的精度依赖于晶体所能够达到的衍射分辨率，获得具有较高衍射能力的晶体仍然是当前蛋白质晶体结构分析的关键。2.数据收集和处理。一般中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，再经过专门的数据处理，最后给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的好坏。3.相位的测定。用X光晶体衍射技术测定晶体结构，其核心问题是解决每个衍射点的相位问题，对不同的对象可采用不同的方法解决其相位问题。4.电子密度图的计算和解释。有了每个衍射点的相角，加上已经收集到的每一个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。5.结构模型修正。从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精修。　　Accelrys公司的软件，例如QUANTA、CNX和DS Modeling等，为从事X射线衍射的研究人员提供科学有效的解决方案，具有自动化和一体化的特点[1]。所谓一体化是指研究人员可以利用软件来完成以上所列举的结构解析的每一步骤，从数据处理到最终的结构修正，都可以通过软件来完成，这对于高通量的晶体学研究而言是非常必要的。例如，研究人员利用Accelrys公司的QUANTA/CNX 或 DS Modeling软件进行模型重建、分子置换法和结构模型修正等工作。自动化的特点将加快研究人员的研究速度，提高效率，为研究人员节省大量时间。　　例如，Francisco G.Hernandez-Guzman博士采用Accelrys公司的QUANTA软件，解析芳基硫酸酯酶A的结构，该结构显示了较高的品质[2]。整个工作流程见图一。Thomas Oldfield使用QUANTA的X-POWERFIT、X-AUTOFIT 和X-BUILD等模块，从头构建了核糖核酸酶的结构[3]。核磁共振技术中的应用　　核磁共振技术是能够测定生物大分子三维空间结构的技术之一。核磁共振研究的生物大分子通常是在与其作用的生理环境温度、盐浓度、pH值等非常相近的溶液中。另一方面，生物大分子中的每一个原子在生命体内总是处于一个运动的状态，而核磁共振技术是研究其动力学特性的有效手段。由于核磁共振技术本身的制约，对其研究的生物大分子的分子量有限制。在10年前，绝大多数溶液结构都是分子量在10kDa以下的蛋白质。近年来，核磁共振技术飞速发展，溶液结构的测定已经应用于分子量为25kDa左右的蛋白质。同时，核磁共振在生物大分子动力学研究中的方法也取得了较大突破。但与X-光晶体学相比较，核磁共振的溶液结构解析无论是在结构测定的速度上、还是在研究的对象上都还有一定的限制。　　对蛋白质质子顺序做专一性识别时，要得到蛋白质-结构，主要根据NOE起始的增长度率和两个质子距离的6次方成反比这一事实。为此需要在20ms~200ms范围内选择不同的混合时间做一系列的NOESY谱。然后做NOE交叉峰的强度随tm变化的曲线，选择适当混合时间的NOESY谱，它的混合时间足够短，不至于由于自旋扩散而影响NOE交叉峰的强度。然后根据这样的NOESY谱中交叉峰的强度及蛋白质结构中的标准距离，得到一个蛋白质中几十对、甚至几百对质子和质子之间距离的上限，至于质子和质子之间的距离的下限则为两原子的范德华半径之和。根据这些从NOE得到的距离约束的数据，来决定蛋白质的-结构。目前采用下面一些方法。（1）在已知二级结构单元的基础上，根据NOESY谱提供的远程的1H—1H距离的信息来确定二级结构单元之间的相对距离，然后用计算机图像系统或球棒搭出模型来。（2）用距离几何的方法，在欧几里德空间得到一个满足所有距离约束的近似模型，获得每个原子的笛卡尔坐标。目前有两种算法，一种是程序DISGEO中用的Metricmatrix方法，它是距离几何算法EMBED的推广。另一个是变目标函数法，用于程序DISMAN。在DISMAN中固定键长键角，以二面角为独立变量，随机选取起始构象，然后通过使目标函数极小化来使蛋白质构象满足所有的距离约束条件。（3）结合能量极小化方法、升温退火的方法和距离约束的分子动力学方法，进行结构修正。　　Accelrys公司的许多软件都能够完成这些工作，其中Felix是核磁共振（NMR）数据处理软件，帮助用户完成从核磁共振信号处理、谱峰指认归属、自旋系统检测和识别到约束条件的产生等NMR谱图分析的各个阶段的工作。同时，Felix与结构计算模块之间有良好的兼容性，产生的约束条件可直接转换成NMR Refine DGII、NMR Refine Advanced的输入文件，用于结构计算[4]。NMR Refine DGII为NMR波谱学工作者提供了根据NMR数据计算和评价生物大分子三维结构所需的全部工具[5]。利用DGII（距离几何）方法解析NMR数据得到分子的三维结构，并用Restraint/Structure Evaluation Database 和ProStat （Protein Structure Analyst）进行精确分析。与NMR Refine DGII 相比，NMR Refine Advanced提供了许多互补和高级的工具，包括NMR Database， MD Schedule， NOE-MD， IRMA， NOE Simulate， Restraint/Structure Evaluation， ProStat， Query，等等。另外，X-PLOR适用于计算结构生物学的程序系统，通过经验能量函数及实验数据的限定，进行大分子空间构象的开发，该程序主要用于X-射线衍射数据及NMR核磁共振数据分析。这些软件结合使用，可通过以下步骤决定生物大分子三维结构。距离几何计算（DG）　1．数据榆入　　首先要将NMR数据、蛋白序列等编成四个输人文件。文件I是所测蛋白质的一级结构及残基编号。文件II，是由NOESY谱所得的质子间距表。对于已知晶体结构的蛋白质，若发现慢交换酰胺质子，正对应于晶体中成氢键的质子供体，则可将此氢键加入文件III。文件IV包含手性信息，首先是对芳香环平面加角度制约，使环保持为一平面，否则会计算出桥式或船式等多种结构。其次，对由aH-NH耦合常数计算出的f角，选J＜5Hz的f角在-90度到-40度之间，形成螺旋结构；而J＜8.5Hz的f角在-160度到80度之间，是为伸展构象。在编完4个输入文件后，即可开始距离几何模拟退火（DG／SA）的第一步计算。除用户输入的4个文件外，计算程序本身也存有一些基本的对照参数，如各种原子的半径，残基的立体几何及残基间连接的几何参数等。第一步计算得出二进制数据库。2．距离范围平滑处理　　第二步计算，先将输入的距离参数编成全矩阵，其上三角包含所给距离制约的上限，而下三角则为距离制约的下限或原子“硬”球半径之和。然后，根据三角不等式以及四角不等式做平滑处理。所谓三角不等式，即任意三角形的两边之和必大于第三边，而两边之差的绝对值必小于第三边。　　3．“嵌入”计算　　将距离信息逐步转化成空间坐标。首先，随机地取出分子可能构像的试算距离。经过三角、四角不等式平滑处理后的距离制约，仍然可有一定变动范围。因此，每一次结构计算，都是随机地由这些距离范围中取出一组数据，作为这一结构计算的初始值。选出的这些数据组成一对称矩阵，但其中的数据都是每两个原子间的距离，整套数据缺乏参考点。因此，随后做“中心化”，先定出整个分子的“质心”（或距离中心）作为参考点，将所有原子间的距离换算成各原子到质心（O）的一整套矢量。这样，矩阵中的各元素变为这些矢量的点乘积。再下一步才是真正的“嵌入”运算，即对这些积算子度量矩阵求解，得几个本征值。此时，找坐标已转化为对正方矩阵求非零本征值。所得三个最大的本征值，即成为近似的笛卡尔三维坐标。而由此坐标算出的积算子，能以最小二乘法最佳拟合于度量矩阵中的积算子。在得出这三维坐标后，要以Gutman转换，以最小二乘法拟合这套坐标。结构优化　　1．能量极小化　　　　生物大分子结构确定的下一步是距离几何计算得到的笛卡尔坐标的优化。能量最小化被用来找到势能的局部极小值。通常所用的能量极小化有三种方法：最陡下降法，共扼梯度法和Newton—Raphson法。这三种方法都假设能量表面近似的和谐，因此在笛卡尔坐标的能量表面上可确确实实的调节原子的位置，而更深的进入局部势阱。2．模拟退火优化处理　　最初的距离几何算法（EMBED），在第三步“嵌入”运算得出坐标后，立即做优化处理。而DGII算法，则在优化前加上模拟退火（SA）处理。在模拟退火后，程序进一步用Shanno的共扼梯度法，在三维空间相对于距离和手性制约、再进一步精化坐标。这里所用的目标函数，也就是模拟退火运算最后所得的误差函数。此外，要设定一计算梯度（RMS梯度）。在略微改变原子坐标后算出的误差函数若小于原值，则按此梯度方向再进一步精化；但若新值大于原值，则或再做计算。整个程序进行到预算的三项指标之一即终止。这三项是目标函数阈值、RMS梯度阈值即重复修正次数。
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