基因治疗的实验方法

将依次确认了各种病毒的分类。　　Box1：体细胞基因治疗的三种类别　　第一种是离体（ex vivo）,这种方法是将细胞从人体中移出，用载体孵化后形成的基因工程细胞再回至人体中，这种步骤常用于血细胞，因为它们最容易被移进移出。　　第二种方法是在位点（in situ）上，这种方法是直接将载体放入需治疗的组织中去。例子是把腺病毒载体浸入带囊纤维病人的气管和支气管中，用携带细胞素或毒素基因的载体注入肿瘤，或将携带有肌细胞增强蛋白的基因直接注入具肌肉营养障碍病人的肌肉中。　　第三种方法是在活体（vivo）上，这种方法的载体能被直接注入血液中，这第三种方法还未有临床例子，但如果基因治疗作为一种治疗选择来完成它的承诺的话，必须开发体内可注入载体。　　以RNA病毒为基础的载体　　逆转录病毒一开始就作为最有希望的基因转化载体来选择的，目前利用逆转录病毒的临床试验占了所有被认可报告的60%。因为RNA病毒能执行将有效基因转化至许多类型细胞中去的任务并能稳定地把它们集合到寄主细胞的基因组中（图1），因而也就提供了长期表达的可能性。因为逆转录病毒已被结合进有关的非致病源寄生物中，所以它有最小的危害性（虽然有例外，例如人类免疫缺陷病毒“HIV”和人类T细胞亲淋巴病毒“HTLV”），尤其是鼠白血病病毒（MULV）已被传统地用于临床基因治疗试验选择，曾开发了把载体基因组封入病毒颗粒的各种包装系统。已被移去所有病毒基因的载体本身是充分复制缺陷并接受达到大约 8Kb（Kilobase）外源性DNA。　　研究人员若要开发高效治疗疾病的逆转录病毒载体，将面临四个关键问题：获得高效输送、传导非分离细胞、维持长期的基因表达和开发制造载体的经济方法。　　获得高效输送。采用逆转录病毒的临床试验报告主要使用体外方法。目前，采用逆转录载体传导的细胞，它们具有高水平的天然MuLV (amphotropic)受体并在暴露载体的时间里进行分离。虽然有少量细胞类型不能被分离，但能在体内生长的大多数细胞能被传导。一种重要的靶细胞是初级的钩状促白细胞生长素干细胞（HSC），因为基因传导进入这类细胞将为受体生命产生基因工程细胞。然而，HSCs有一种低水平的酸-碱兼性受体，它具弱传导性。因此，HSCs仍是重要的目标但难以捉摸。　　具有兼性受体的广泛范围的细胞类型据知是磷酸盐同向运转，这种磷酸盐限制了这些受体在体内方法中特殊目标的运用。使用不同的病毒包封认识不同受体的蛋白质，（例如，囊状口炎病毒（VSV）-G蛋白或gibbon类人猿白血病病毒（GALV）包封蛋白）,能改变受到传导的细胞范围，但仍不能提供更多特异性。其困难在于，因为逆转录病毒不能在高滴定度上产生，（兼性受体将被限制于每毫升形成1×107菌落单位和假型VSV-G受体至每毫升1× 109CFU），这不可能为in vivo期望的细胞类型得到大量的受体颗粒。病毒颗粒将被束缚于它们遭遇到的许多细胞中，这样，在它们到达它们的目标之前就已被稀释出去。（其它的组织，例如中间补体消失将在后面讨论）。问题能定量化，人体包含大约5×1013细胞，如果一个病人得到100毫升逆转录病毒样品，那大约是1×109活性载体颗粒。即使每一受体颗粒对感染是100%特异性，只要有1/50000细胞被传导。需要的东西是优先束缚于它的目标的逆转录病毒颗粒并能在高滴定度上制造出来。　　对特殊靶细胞类型的探索已集中于企图建造天然逆转录病毒包封蛋白上。包封蛋白有两种功能：束缚于它的受体，（通过表面（SU）部分）能进入病毒核蛋白核心中（主要由转导膜（TM）部分执行）。SU蛋白束缚于靶细胞表面的受体上，因此，经SU/TM络合，使病毒和细胞膜产生结构变化，接着病毒核（带有病毒的遗传信息）进入靶细胞的细胞质中。（图1）。　　提供靶细胞特殊性的两种主要方法继续进行。首先，SU蛋白的天然束缚受体区域曾被配体或认识特殊细胞表面受体的单链抗体所代替，曾靶向范围广泛的收体。但是困难在于，即使在工程化载体和靶细胞受体之间能获得特殊束缚，在实验中的基因转化仍很低。理由是清楚的，想象逆转录病毒包封蛋白将变成了具有络合四元结构的三聚体。当天然束缚区域被外来序列取代时，整个包封蛋白的结构发生变化，结果产生新的蛋白构象，这种改变导致了不能发生病毒和细胞膜之间的融合，没有融合就不能发生有效的核进入和基因转化。　　在创建US的束缚受体区域的同时，为执行核进入而保持包封蛋白的能力将需要更好地掌握包封络合蛋白中的结构—功能关系。这种认识随着最近发表的有关鼠亲病毒SU蛋白束缚受体区域的三维结构而获得进展。工程化配体嵌进具有为核进入而保持包封蛋白功能性高机率的SU蛋白中的各个特殊位置，目前成为可能。　　逆转录病毒包封蛋白的另一个结构—功能研究也有助于我们理解在束缚后如何获得高效的核进入。去年发表了Moloney亲病毒逆转录病毒TM蛋白的部分三维结构。最近在预见包封蛋白的三聚结构中，已显示出它的分离单体能彼此交联。换句话说，每个有缺陷的分离单体，彼此能互补以便提供一种活性三聚体包封。运用这种工艺有可能去定义TM蛋白中的分离功能区域。当使完成包封蛋白三维结构和功能区域变成可知时，具有高效靶特性细胞的结构逆转病毒载体有可能产生。运用第二种主要的称之为“链”（tethering）靶方法曾获得进展。虽然曾设计了几种创造性系统，但目前最成功的方法是将认识细胞外基质（ECM）成份的配体嵌进不能扰乱天然束缚受体区域的部分SU蛋白中。链（tethering）浓缩靶细胞附近ECM中的载体。然后束缚受体和核进入通过天然包封—受体机理产生。出现特别用于基质的两种配体是特性溶胶、纤维结合素。纤维结合素是存在于正常的ECM中，暴露的溶胶存在于危险区域，例如，血管成形术后心血管系统伤口损伤处。　　非分离细胞的传导。虽然基于MULV的逆转录病毒载体不能去传导非分离细胞这点在某些状态非常有用，例如，当毒素基因被嵌进分离癌细胞并不会进入正常的非分离细胞（见下面的 “临床试验”），在许多状态中，有一种要求即把一种治疗基因嵌进正常的非分离细胞中。许多潜在的靶细胞不会激活分离活体；只有某些血细胞（而不是干细胞）和细胞衬里胃肠束继续分离。慢病毒（例HIV—1）能够感染非分离细胞，因为再结合能产生致病原病毒的可能性而使这些病毒来的载体结构超过安全范围。企图转化至鼠逆转录病毒，结果从允许传导非分离细胞HIV来的特殊信号没有获得成功。最近，有可能在逆转录病毒中使用刚好22%的HIV基因组（不包含任何引起病源体的基因）。由于使用了非—HIV外膜蛋白而进一步减少了再结合的机会。杂交系统（hybrid system）以同样的方式为提供体内传导非分离细胞的选择负有重大责任。另一种正在开发的RNA病毒是根据人类泡沫病毒来开发的。这些载体能传导广泛范围的细胞类型，不能被人类血清激活，并有可能传导某些非分离及分离细胞。改进基因表达。假设开发高效的基因能传导的话，那末接下来的目标便是使基因表达长效稳定在一个合适水平上，这正是当前载体最大的不足。虽然我们仅是在逆转病毒载体中讨论基因表达问题，但它可应用到所有类型的基因传导载体中。　　基因转化后要保持稳定的表达，与几种因素有关。首先，控制基因表达的调节顺序不能经常保持活化状态。存在一种细胞认识外来催化剂的的趋势，（尤其如类人猿病毒40（SV40）和巨细胞病毒（CMV）），并不能激活它们（通过甲基化或其它机理）。到目前为止，仍很少掌握淋巴激活素、细胞素和其它生长因素在基因表达中的作用。其次，即使基因在细胞中保持活性但细胞经常死亡。为识别、消除外源基因产物及产生外源蛋白细胞而设计免疫系统，从逆转录病毒载体中消除所有病毒基因。所以，病毒蛋白的免疫识别（有一种情况例外，如病毒壳体蛋白被包埋在病毒颗粒中）不是目的（但见下面腺体载体的讨论）。尽管如此，免疫系统仍可能识别由治疗基因产生的新的或修正过的蛋白；一种新合成的正常蛋白将对从未为它暴露过的免疫系统作出反常表现。　　细胞自身顺-调节DNA序列的使用将可能比用病毒催化剂获得更稳定长效基因表达，但要确认基因调节系统的所有成分可能是困难的。作为一种极端的情况，与血红蛋白（B-珠蛋白）基因部分调节有关的调节序列扩散超过近100kb。因为逆转录病毒仅能提供6—8Kb序列，所以被结合到这种载体前可能需要截断调节序列至它们的最小基本长度。甚至当使用天然调节分子时，因缺乏微弱信号和适宜细胞环境的正常操作反馈机理而不能校正功能。例如，当胰岛素增强剂/催化剂输送至成纤维细胞中去时仍不能调节表达。再有，要强调的是：需要开发具有基因转化成特殊细胞型能力的载体。　　根据各方面的稳步进展，长久、稳定和适宜的体内基因，将在广泛范围细胞型中完成表达。一旦清除了这些障碍，那么下一步的目标将是获得能调节的基因表达。许多重要的靶基因，例如，胰岛素不能在所有时间表达在同样水平上，而且应答体内的生理信号。目标是使用应答体内自身的生理信号（为此嵌入的治疗基因起到内源基因运行的作用）或者输送能控制基因活性水平的药物。在某些情况下，仅保持基本不起调节表达的低水平可能是有利的，（例如，血友病或腺苷脱氨基酶（ADA）缺陷），而在另一种情况下，可能需要牢固的调节（例如。糖尿病中的胰岛素生产）。　　制造载体。虽然10年前，医药公司还不能生产上百万基因治疗载体药片，现在却能够了。逆转录病毒载体是生物剂：它们只能从活体细胞中制得。生物学系统在执行由食品和药物行政管理机构制定的产品制造工艺（GMP）、质量安全/质量控制步骤上（GA/GC），不是件最容易的事，疫苗生产已经学到了。　　与逆转录病毒载体相关的主要问题之一，是有可能在制造过程中增加复制活性逆转录病毒。因为，逆转录病毒载体是在包裹缺陷病毒基因组的包裹细胞中生产出来的，因为逆转录病毒载体有高的再结合倾向，所以上述的可能性出现了。进一步说，当每一个哺乳动物包含内源逆转录病毒时，附加的病毒序列可能被结合进 RCR，或许就产生了致病源病毒。　　另一个潜在的问题起因于逆转录病毒载体随机结合进入寄主细胞DNA中的能力。例如载体可能自身嵌进肿瘤超表达基因中去，这样就增加了细胞演变成癌细胞的倾向。1992年发表了在大型动物逆转录病毒基因转化实验中，出现唯一并不要求产生肿瘤的例子。在10只猕猴的骨髓受到辐射破坏时，报道了淋巴瘤的三种情况，然后用曾对大量RCR（而不是逆转录病毒载体）和实验载体暴露过的造血干细胞，做骨髓移植，结果表明产生了RCR集聚的癌，是交流活动且仅是在逆转录病毒6---7个月后发展起来的。共2页: 上一页 1 [2] 下一页
< 1 > < 2 >

设为首页 | 加入收藏 | 广告服务 | 友情链接 | 版权申明