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到探针来源的限制，所需 DNA 样品量大（因没有对 DNA 进行扩增），仅适于 DNA 未明显降解的新鲜材料。因此限制了其广泛应用，随着 PCR 技术的出现和发展， PCR-RFLP 技术较多的应用于中药真实性鉴别领域。 （二）随机扩增多态性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ） RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。 Williams 称之为 RAPD （ random amplified polymorphic DNA ） ， Welsh 称之为 AP-PCR （ arbitrary primer PCR ）。 RAPD 技术建立在 PCR 技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链 ( 通常为 10 个碱基， AP-PCR 则为 20 ～ 30 个碱基 ) 为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的 DNA 片段。在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。 通过对 PCR 产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。 与常规 PCR 相比， RAPD 主要有以下特点： ① 无需专门设计 RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为 9 ～ 10 个寡核苷酸。 ② 每个 RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。 ③ 退火温度较低，一般为 36℃ ，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机性。 ④ 较之常规 PCR ， RAPD 反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助计算机进行系统分析。 该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。 （三）扩增片段长度多态性标记（ amplified fragment length polymorphic DNA marker ， AFLP ） AFLP 标记是 RFLP 与 RAPD 相结合的产物，是 1992 年由荷兰 Keygene 公司科学家 Vos Pieter 等发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法。 AFLP 检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间 DNA 序列的插入与缺失，本质上与 RFLP 一致。该技术将随机性与专一性扩增巧妙结合，并通过变换引物的种类和组合来选择扩增不同的 DNA 片段和数目，此外，还可以通过选用不同的内切酶以达到选择目的。 AFLP 较其他分子标记有着明显的优越性： ①AFLP 可在不知基因组 DNA 序列情况下构建其指纹图谱。 ② AFLP 所需 DNA 用量少。 ③ AFLP 反应灵敏、快速高效。 ④ AFLP 指纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差异。 ⑤ AFLP 标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到整个基因组的遗传变异。 ⑥AFLP 对反映条件的变化如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。 ⑦AFLP 采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，且采用了较高的退火温度，特异性较高。正是由于该技术具有以上优点，在短短的几年里，在遗传多样性、基因追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等基因组研究的几乎所有领域都得到了广泛的应用。其不足之处是所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。另外检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和人身安全构成一定的危害。 （四） DNA 测序法和基于 DNA 序列测定的 PCR-RFLP 、特异引物 PCR 方法 基于 PCR 技术的 DNA 直接测序技术是以 PCR 扩增引物作为测序引物，采用循环测序法对 PCR 扩增的双链 DNA 进行直接测序。 PCR 扩增所需要的基本条件是引物所覆盖区域的 DNA 序列必须是已知的，以便根据其序列来设计引物，也就是说需要预先知道靶基因的序列信息。由于生药的遗传信息缺乏，应用 DNA 测序法鉴定中药，一般是选择合适的目的基因，根据其保守区的序列设计通用引物，使其在靶基因保守区识别并扩增，这样可以对不同分类等级生物类群的 DNA 进行扩增，而不需要预先知道靶基因的序列信息，使应用 DNA 测序法鉴别生药成为可能。 生药的 DNA 测序鉴定就是运用 DNA 测序技术建立正品药材及相关混伪品的原动植物的基因序列数据库，用同样的方法对待检测样品进行测序，对照数据库即可鉴定出中药材的真伪。该方法重现性好，鉴定结果准确可靠。但是，实际应用中，采用全序列比对的方法比较麻烦，为此又在序列测定的基础上发展了更加简便的 PCR 扩增的特定片段的限制性位点分析（ PCR-RFLP ）和位点特异性鉴别 PCR 方法（ diagnostic PCR ）。 PCR-RFLP 是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有种属特异性的电泳谱带，从而达到品种鉴定的目的。例如该方法在贝母类、人参类和术类药材鉴定中应用。 自 De Salle R, Birstein VJ 1996 年在 Nature 上发表了利用人工设计的引物鉴别鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼的种类后，鉴别性 PCR 不断得到推广和应用。位点特异性鉴别 PCR （ diagnostic PCR ）方法是根据正品及其混伪品特定区域的 DNA 序列数据，设计有高度特异性的正品药材的鉴别引物。与通用引物不同的是，这对引物在 PCR 扩增时只能对来自正品的药材的 DNA 模板中的特定的区域进行有效扩增，而对来自混伪品或其它样品中该区域不能进行扩增。高特异性 PCR 鉴别反应条件与普通 PCR 基本一样，但在 PCR 循环中复性温度较高，一般在 60℃ 左右。在这样的 PCR 条件下，如果引物设计合理，假阳性出现的概率非常之微。当有样品鉴定时，从待鉴定的样品中提取少量 DNA ，以此为模板，用高特异性的鉴别引物在适当的条件下进行 PCR 扩增， PCR 产物用 0.8%~1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如为阳性，则为正品，否则为非正品药材，以此达到鉴别目的。高特异性鉴别引物设计所依据的 DNA 序列资料，可以通过对相关物种的 DNA 进行测序研究获得，也可以从 GenBank 或 EMBL 等 DNA 数据库中直接查得。例如该方法已在贝母类、石斛类、蛇类和龟甲类药材鉴定中应用。
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