PCR技术

5℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合； ③ 引物的延伸 DNA 模板 - 引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性 - 退火 - 延伸三过程，就可获得更多的 “ 半保留复制链 ” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 ～ 4 分钟， 2 ～ 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 2. 参加 PCR 反应的物质　　主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg 2+ 。（1 ）引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。（2 ）酶及其浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U( 指总反应体积为 100μl 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3 ） dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 7.0 ～ 7.5 ，小量分装， -20℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中， dNTP 的浓度应为 50 ～ 200μmol/L ，尤其应注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。浓度过低还会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg 2+ 结合，使游离的 Mg 2+ 浓度降低。（4 ）模板 ( 靶基因 ) 质量模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚 /SDS 法等，要防止 RNase 降解 RNA 。（5 ） Mg 2+ 浓度 Mg 2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200μmol/L 时， Mg 2+ 浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L 为宜。 Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。
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