石蜡包埋组织的DNA提取及其应用

织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤 1．切除多余石蜡，暴露组织 2．将组织切碎（最大径<0.5mm），称重； 3．溶于TE9提取液（组织<50mg/5ml,50～500mg/10ml）,高速混悬2～3min；于48℃放置24h，其制备见表18-6； 4．再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h； 5．用等体积酚-氯仿溶液抽提3次； 6．2.5倍体积乙醇沉淀DNA 7．-70℃放置2～4h 8．9000×g离心1h 9．沉淀物用70%乙醇洗1次 10．干燥，TE（pH7.2）溶解。表18-6 TE9 DNA提取液的制备 500mmol/L Tris 20mmol/L EDTA 10mmoo/L NaCl 1% SDS 500μg/ml 蛋白酶K 　 PH8.0 5μm组织切片↓常规脱蜡、水化↓第一次溶液A孵育（去上清）↓第二次溶液A孵育（留上清）↓氯仿-异戊醇抽提↓RNA酶和蛋白酶消化↓酚抽提↓沉淀↓（却除未螺旋化DNA）↓透析图18-6　石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986）溶液A 2×SSC 100μg 蛋白酶K/ml 1% SDS 共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页
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