银染操作中的一点心得

应只产物一条（纯合）或两条（杂合）带，同时本研究材料为二倍体，每个材料在检测时应只产生一条或两条带，然而，在实际检测过程中，发现一些微卫星位点会出现一系列谱带（赝带）的情况，而且赝带（shutter bands）通常比主带弱，分子量比主带小。这种现象与许多学者的研究一致（Brian, 1997; Hoelzel, 1998; Hayden, 2001a ,2001b; Rodriguez, 2002; Vitor, 2003）。究其原因，Hoelzel等（1998）指出，这种现象可能是在PCR扩增过程中，DNA滑动引起的，赝带的强弱反应了DNA滑动的概率大小，偏离主带越大的片段越弱，这种概率也越小。这种DNA滑动的概率随着重复序列的变大而变小，在二核苷酸重复序列种出现的频率要比在三核苷酸或四核苷酸重复序列中出现的大。除了赝带外，在胶上还会出现一种分子量比主带大并可能对条带判读造成干扰的带型。这种带型可能是由于在PCR扩增过程中，Taq酶的末端转移酶活性将A加到PCR扩增产物上所造成的。然而Taq酶的这种末端转移酶活性依赖于聚合酶与引物。Hoelzel等（1998）还指出，当今，只有对主带和所有的赝带（shutter bands）都判读时，实验结果才可靠。近年来，有很多研究报道通过测序仪的毛细管电泳结合荧光标记来开展微卫星研究，测序仪的DN-段分析功能（Genescan）可以对微卫星的PCR产物进行精确的分析，可以免受在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过程中出现的种种不利因素的干扰，得到最忠实的实验结果。对于丙烯酰胺凝胶银染补充一点经验：1，倒胶时为防胶的漏出，可在凝胶板底部的橡胶垫下垫起一些，以拧紧两边旋钮，使凝胶板底与橡胶垫紧贴，如此几乎不会漏胶 2，染色后水洗时间切记不能太长，一般每次不宜超过30s（我是用去离子水洗3次），否则，dna就洗掉了，染出来颜色背景是黑的，dna处则为白色 3，装胶时，要小心操作，莫凝胶板内的胶受离不均，内部拉伸或紧缩，这样跑出来带形会倾斜 4，点样应迅速操作，不可耽搁太久，否则，样品会流失我做pcr采用的是touch-down pcr，这样避免各个引物都要调pcr反应参数，取得了显著效果以上都是些本人个人经验之谈，大家批评指正！！
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