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PCR技术,在遗传病的异常基因分析、肿瘤分子标志物的判定以及疾病病原体的检测上已广泛应用。在实践中我们发现有三个问题急待解决:(1)PCR产物的污染;(2)PCR产物自动化的检测手段;(3)PCR模板的定量。我们吸取国内外经验,研究和建立了一种新的PCR检测体系,使之能基本解决上述问题。 一、新检测体系的主要组成 1.在PCR反应体系上:(1)以dUTP代替普通PCR中的dTTP,(2)加入专门识别、切断双链上的dUTP的尿嘧啶N-糖基化酶(Uracil N-Glycosylase);(3)所应用的特异引物是由生物素(biotin)标记的。 2.杂交:PCR产物的杂交反应,在已包被特异探针的酶标盘上进行。 3.类似Elisa方法的检测系统:洗去杂交后酶标盘上的游离物质后,将卵白素(avidin)与辣根过氧化物酶的偶联液加入酶标盘,与因杂交而被固定在酶标盘底的biotin相结合,并与过氧化物和麝香草酚蓝(TMB)形成颜色复合物,经酶标仪测吸光度(A,曾称光密度)值定量。 二、操作的具体步骤 1.DNA模板制备:50 μl待检标本与200 μl提取液混匀,60℃ 30分钟,100℃ 30分钟(不能用水浴方式)。 2.PCR扩增:50 μl PCR液(尿嘧啶N-糖基化酶,Bio-引物,AUGC四种碱基,Taq酶,缓冲液),加入50 μl模 < 1 > < 2 >
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