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激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。一、仪器设备1． 12×75mm有盖的Falcon管（BD Catalog No.2058）2． 37℃孵箱5％CO23． 混匀振荡器4． 离心机5． 加样枪、Tips6． FACS流式细胞仪二、细胞1、全血 使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAINER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs) 使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。3、 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs) 用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640。4、 细胞系与T细胞克隆 调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。5、冰冻全血与PBMCs 应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1％的BSA及10％的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液 通透与染色。三、刺激试剂与抗体1、PMA（Sigma catalog No.P-8139） 打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1mg包装的小瓶，打开迅速加入1ml的无水乙醇或DMSO。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1.5ml的e.p.管中,每管10μl,取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。2、离子霉素Ionomycin(Sigma catalog No.I-0634) 打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100支1.5ml的e.p.管中，每支10μl，取出1支待用，其余19支冻存于-70℃或-20℃冰箱，3、Golgistop或Golgiplug,（catalog No.555029或554724） 详细请见说明书4、所需相应的抗体，如CD4、CD8、CD3、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、CD69等。最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血5、离子霉素：1μg/ml全血6、FACS溶血素FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用： (1) 全血制备时用于溶解红细胞(2) 固定外表位(3) 辅助通透剂 FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。7、FACS通透液 BD推出FACS通透液（BDIS Catalog No.340973）以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。 FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。8、DMSO、乙醇、洗液PBS（含1%BSA与0.09%NaN3）, RPMI1640, 4℃储存。9、细胞内染色的标记荧光单抗试剂依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记IFNγ-FITC/IL-4PE与CD3PerCP组合是同时研究TH1与TH2型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。四、对照 正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。1、 未刺激对照 未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与10μg/mLBFA或莫能霉素共孵育，不加刺激剂。2、 同型对照 同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗-KLH同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。3、 激活对照 激活对照使用细胞表面表达CD69 来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。a. 取部分血样加PMA+I但是不加莫能霉素或BFA（抑分泌试剂如BFA会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测）。b. 表面染色CD69PE/CD3PerCP，省略通透与胞内染色步骤。c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，表面CD69染色阳性率应在90%以上。4、 胞内染色对照 胞内染色对照通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。a. 取部分血样加PMA+I+Golgistopb. 省略表面染色，胞内染色CD69PE/CD3PerCP（BDIS Cat.No.340368）c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，胞内CD69染色阳性率应在90%以上。 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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