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导致产生不同的RT-PCR结果。 产生弥散（smear）条带 A: 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高B: 减少引物的用量C: 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数D: 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。 产生大分子量的弥散条带 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200） 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果 A: 通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。B: 有可能是引物二聚体的条带 扩增产物滞留在加样孔中 A: 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。B: 建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。C: 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。 为什么使用基因特异性引物（GSP）？ GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRN-段的逆转录。 什么情况下需要使用RNase H？ 在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时 根据不同的目的选择不同的系统： 目的 建议 RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统 高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统 高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统 高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统 长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
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