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头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心 5min后收集细胞或进行密度梯度离心。（2）将单细胞悬液于1：2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。注意：密度梯度离心力500g×30min组优于800g×30min。本步骤可以省略。附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u肝素抗凝，充分混匀后，保存于4℃冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液(或培养液)混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077）， 水平离心机20℃条件下500g（2000r/min？）离心25～30分钟。从界面上取出的MNC用 PBS液洗涤2～3次后，加适量培养液计数。（3）数细胞数量，达到106～107/ml后即进行原代培养，按5×106/ml浓度接种于50ml培养瓶中（1×106/cm2培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3～4d半量换液1次，10～12d细胞达90%融合时传代。(4)传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+ 、Mg2+ PBS液洗涤二次，加入37℃预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制)消化1～2分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用 PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞再悬浮于培养液中，按2～5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓MSC。传至3～5代的MSC按1×105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。注：贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。
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