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剂则标记在另一端。在复性温度下,因为模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除,发出激发光子。由于是酶切作用的存在,分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团:FAM ,Texas Red 。 3.SYBR Green I SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后, 荧光大大增强。因此, SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。 SYBR Green I 的缺点:由于SYBR Green I没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光。所以在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green I的优点:SYBR Green I的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制,通用性好,并且价格相对较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。 4. 荧光谐振能量传递(FRET) FRET探针是罗氏的发明专利,又称双杂交探针,FRET探针由两条相邻探针组成,在一条探针的5`端标记FAM荧光基团,另一探针的3`端标记Red 640荧光基团。当复性时,探针结合在模板上,FAM基团和Red640基团相邻,激发FAM产生的荧光,作为Red640基团的激发光被吸收,使Red640发出波长为640的荧光。当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,非累积信号。常用的荧光基团是:LC-Red640,LC-Red705。 5.LUX Primers LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物,使引物同时起到荧光探针的作。引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在模板存在的情况下,引物与模板配对,发夹结构打开,产生荧光信号。使用LUX引物,不需要专门设计探针,即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性,因此他的特异性要弱于探针技术,但非特异性扩增或引物二聚体没有影响,所以其特异性要强于SYBR GREEN。 图.LUX 引物工作原理 能用于实时荧光PCR定量的方法很多,各有特点。 SYBR GREEN FRET探针 Taqman 分子信标 LUX 引物 性质 可逆荧光 积累荧光 熔点分析 能 不能 特异性 引物(非特异性扩增或引物二聚体有影响) 引物+2探针 引物+探针 引物+探针 引物(非特异性扩增或引物二聚体无影响) 探针 不需要 需要 需要 需要 不需要 通用性 通用 专用 专用 专用 专用 < 1 > < 2 >
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