单纯疱疹病毒感染的诊断方法

片段(S)组成，每一片段均含有单一序列和反转重复序列，长重复序列(RL)和短重复序列(Rs)中含有命名的为a的末端重复序列，由约400碱基对(bp)组成，在L和S片段之间，插有a的反转重序列，称为a.由于L和S片段连接的方式不同，HSV的DNA共有4种同分异构体.HSV-117syn株的全部DNA序列已经弄清.该毒株DNA共含有152260个核苷酸残基，其中碱性核苷酸鸟苷酸和胞苷酸的含量(G+C)较高，达68.3%.HSV-1的基因组上，共排列有72个编码蛋白的基因，其中长单一序列(UL)上有56个，短单一序列(Us)上有12个，Us末端反转重复序列(TRL)，Us末端反转重复序列(TRs)，UL中间反转重复序列(IRL)和Us中间反转重复序列(IRs)上各一个，由于TRL和IRS上各有一个IE110基因，而TRs和IRs上各有一个IE175基因，所以HSV-1基因组上的72个基因共编码70个各异的蛋白质.在HSV-1的72个编码基因中，约半数的基因转录时阅读方向是从左至右的(右向)，但有37个基因的阅读方向是从右至左的(左向).在所有基因3末端的上游，均有多聚腺苷化序列AATAA或ATTAA作为转录的起始.(二)引物设计部位与序列及其意义　　1.引物设计部位及意义　　人类5种主要的疱疹病毒基因组的全序列测定即将完成，目前的研究资料显示HSV-1和HSV-2在核苷酸水平上有50%的同源性.HSV与EBV在DNA多聚酶，核糖核酸还原酶A、B单位以及糖蛋白B等方面有相当的同源性.HSV与CMV在DNA多聚酶等亦有相当的同源性.采用HSVDNA多聚酶基因作探针，在非严格条件下可以检出CMVDNA多聚酶基因，总之HSV-1、HSV-2、EBV和CMV4个疱疹病毒DNA多聚酶氨基酸序列，均有相当的同源性，基于这些理论，RozenbergF等人，根据疱疹病毒DNA聚合酶基因设计了一对寡核苷酸引物，用这对引物进行PCR，可以扩增出HSV-1，HSV-2EBV和CMV相应的DN-段.如果配合对PCR产物进行限制性内切酶分析或特异性探针进行核酸杂交，便可将4个疱疹病毒分出.HSVDNA扩增区的选择主要集中在DNA聚合酶基因区，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因区和糖蛋白基因区，检测HSV的PCR法有直接PCR法，巢式PCR法，免疫捕捉PCR法，和直接分型检测PCR法.　　2.引物序列及PCR结果判断　　引物1:CGACTTTGCCAGCCTGTACC，HSV-1518bp　　引物2:AGTCCGTGTCCCCGTAGATG，HSV-2518bp　　HSV-1/HSV-2型共同引物:ATGGTGAACATCGACATGTACGG，1561-1583469bp，(HSV-1)　　HSV-1型特异引物：CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC，2337-2359，391bp，(HSV-2)　　HSV-2型特异引物：CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC，1929-1951　　探针：GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG，1675-1699　　引物1：ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA　　引物2：CATACCGGAACGCACCACAACAA　　内引物　　引物1：CCATACCGACCACACCGACGA　　引物2：GGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA　　探针：TACGAGGAGGAGGGGTATAACAAAGTCTGT　　引物1：ACGACGACGTCCGACGGCGA　　引物2：GTGCTGGTGCTGGACGACAC　　探针：ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGA单纯疱疹病毒感染的检测现状　　为了从根本上控制HSV的流行，做好防治工作，加强实验室诊断方法的研究，为临床提供特异，敏感、早期、快速的诊断方法是非常必要的.(一)病毒分离（细胞培养）　　1.基本原理:细胞培养是以组织活细胞为母体，使活病毒得到扩增，引起宿主细胞病变(CPE).通过CPE出现的时间，特征等进行病毒检测.　　2.方法评估:敏感的细胞系具有很高的标本检出率.经研究表明，在细胞培养中，只要有1-10个感染性HSV就可以检出，而ELISA和核酸杂交则需要104～106病毒颗粒，所以，细胞培养被广泛当作其它方法研究的参考--金标准.HSV可以在多种动物细胞中增殖，乳地鼠肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人胚肺细胞(HEL)、原代兔肾细胞(PRKL)、恒河猴胎肾细胞(FRHK)、人胎包皮细胞(HFF)、貂肺细胞(ML)、人肺癌细胞(A549、人包皮成纤维母细胞(MRC-5)、人新生儿肾细胞(HNK)等.在前面7种细胞中，以PRK出现CPE最早，其余依次是HFF、HEL、Vero.但各个实验室常以自已的条件，习惯来选择合适的细胞系.细胞分离HSV的临床标本检出率在15～99.5%.阳性高低不仅与细胞系敏感性有关，还与标本的来源部位，感染与恢复状况以及取材与送检过程、贮存都有很大关系.尽管HSV较易培养，但细胞培养费时、费事，使这一方法在临床检验工作中的普及应用受到限制.　　3.研究与改进:(1)增强病毒的吸附.Winter和Lin用SVCC(Shell Viral Cell cultures)法，通过在特制的细胞培养瓶中种毒后，经700×g离心1h，然后培养可提高HSV检出率和缩短产生CPE时间.(1)与免疫学方法结合.利用活病毒在细胞内的扩增作用，再用免疫学技术进行快速诊断，如免疫荧光法(IFA)、免疫过氧化物酶法(IP)、生物素免疫荧光法(BA-IFA)等，缩短了细胞产生CPE结果鉴定标本的时间，并提高了特异性.(2)存在问题.需发现更好的细胞系，以便提高临床标本的总检出率;且实验室间方法及结果存在差异，需要进行方法学上的标准化;引进更灵敏的免疫学方法或其它技术，缩短时间、简化条件、提高特异性. 共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页
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