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0内含子各有一个STR，是多为DNDR核心是(CA)n.等位基因数目为2-19个.三、DMD基因的突变类型 (一)缺失与重复:研究表明约65%的DMD/BMD是由于基因内的部分缺失所致，尚有12.5%病例有基因内重复，这种突变变有两个高频发生区，一个在基因的5端，另一个大致在第45～55外显子区域，而5端的缺失重复热点大致在第1～7外显子区域.缺失的范围从1至数个外显子，甚至整个DMD基因亦可发生缺失，启动子区亦有缺失发生. (二)单碱量换:近年来的研究还发现，在DMD基因内尚有单碱其置换，目前已发现的约有6种，根认为在DMD患者中由此型突变引起者占30%左右. (三)基因内连接形成和mRNA剪接异常:以上两种类型的突变亦在DMD人群中有抗，但因研究的病印例尚少，需要进上步的研究.四、利用PCR技术诊断DMD的途径(一)用PCR技术检测缺失型突变. 利用PCR可直接检出DMD/BMD的缺失型突变，由于DMD/BMD发生时，其65%的患者为基因缺失所致，因此直接检测缺失可使65%的患者得到诊断.在DMD/BMD基因的缺失中，其缺失范围，缺失的位置具有高度异质性，加之DMD/BMD基因较大，很难用一对引物确定其缺失部位，随着DMD/BMD基因的克隆及其精结构的阐明，有人开发了多时引物进行多重PCR，从而可使几乎全部的缺失型DMD/BMD得到诊断. 1.利用6对引物扩增处于缺失热点区域的6个外显子，即外显子8，16，19，44，45和48，再加上外显子4，12，51的3对引物，可检测80%的缺失，若再用Beggs等设计的另外九对引物即外显子3，6，13，46，47，49，50，52，30，60及启动子的引物，进行多重PCR，可使98%的缺失型患者得到诊断，各引物的序列及扩增片段大小见表. 在用多重PCR进行DMD/BMD基因的缺失型检测时方便简便，快速，在扩增后，用琼脂糖凝胶电泳溴乙锭染色可根据扩增产物的有无判断结果.扩增时的分清情况见下表:DMD基因PCR扩增引物 外显子 引物序列(5--3) 产物片段 Pm GAAGATCTAGACAGTGGATACATAACAAATGCATG 535 TTCTCCGAAGGTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCC 3 TCATCCATCATCTTCGGCAGATTAA 410 CAGGCGGTAGAGTATGCCAAATGAAAATCA 4 TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG 196 GAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 6 CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA 202 GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG 8 GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG 360 GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG 12 GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC 331 GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT 13 AATAGGAGTACCTGAGATGTAGCAGAAAT 238 CTGACCTTAAGTTGTTCTTCCAAAGCAG 17 GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC 416 AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC 19 TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA 459 GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC 43 GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG 357 ATATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC 44 CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA 268 TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT 45 AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC 547 上 CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC 47 CGTTHTTHCSTTTHTCTHTTTCAGTTAC 181 GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG 48 TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG 506 CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC 49 GTGCCCTTATGTACCAGGCAGAAATTG 439 GCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 50 CACCAAATGGATTAAGATGTTCATGAAT 271 TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG 51 GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC 388 GGAGAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATC 52 AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC 113 TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC 60 AGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG 139 CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTGTTCAGG (二)单个碱基置换的检测 单碱是置换在DMD/BMD的发生中占有重要地位，但DMD/BMD是因单碱基置换近年来才受到人们的重视，它对发现新突变，确定单碱基置换与DMD/BMD发生的关系具有重要意义，推测的方法主要是用RT-PCR-SSCP及全套式RF-PCR检测.(三)利用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析诊断DMD/BMD 若在一个家庭中，已有一个先证者，则首先利用多重PCR检测其缺失，若不能确定其缺失的部位或不能诊断，或其它条件所限，则可用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析，确定风险染色体. 1.PCR-RFLP 用多重PCR不能检出非缺失型DMD/BMD患者及携带者，现在可用PCR方法扩增多态性位点区域，同适当的内切酶酶解扩增产物，电泳分离后可对多态性位点进行分布，利用PCR-RFLP连锁分析，即可进行DMD/BMD风险个体的携带者的检出，下表序列即为常用的几个多态性位点检测时的引物及扩增酶解情况. 扩增区域 引物序列 限制性酶 扩增产物 水解片段 PERT87-1 5GTCAGTTGGTCAGTAAAAGCC3 B5＋NⅠ 400bp 400/250＋150 PERT87-8 5CCAATTAAAACCACAGCAG3 TaqⅠ 155bp 145＋10/74＋71＋10 pERT87-15 5GACTGGAGCAAGGGTCGCC3 XmaⅠ 740bp 730＋10/520＋210＋10 PERT87-15 5ACAATTTCCCTTTCATTCCAG3 BamHⅠ 226bp 216＋10/166＋50＋10 MPIP 5TCCAGTAACGGAAAGTGC3 AluⅠ 60bp 60/56or52 841Q 5ATAATTCTGAATAGTCACAAAAG3 MaeⅢ 252bp 236＋16/128＋108＋16 2.AmP-FLP 在DMD/BMD基因区内有多个(CA)n重复区域，这些区域可用OCR方法进行扩增，增产物同聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析扩增片段大小，然后与先证者及母亲进行对比，亦是检出患者与携带者的理想多态性标记，现将在我国人群中已作分析的(CA)n区引物及多态性片段，PIC列表示下: 位置 名称 等位基因 引物序列 片段 PIC 5脑组织特异启动子 DYS-Ⅱ 8 F5TCTTGATATATAGGGATTATTTGTGTTTGTTATAC 214-218 0.750 R5ATTATGAAACTATAAGGAATAACTCATTTAGC 3非翻译区 3CA 4 F5GAAAGATTGTAAACTAAAGTGTGC 119-137 0.375 R5GGATGCAAAACAATGCGCTGCCTC 内含子 44CA 9 F5TCCAACATTGGAAATCACATTTCAA 174-204 0.072 R5TCATCACAAATAGATGTTTCACAG 45CA 7 F5GAGGCTATAATTCTTTAACTTTGGC 156-184 0.772 R5CTCTTTCCCTCTTTATTCATGTTAC 49CA 11 F5CGTTTACCAGCTCAAATCTCAAC 227-257 0.870 R5CATATGATACGATTCGTGTTTTGC 50CA 4 F5AAGGTTCCTCCAGTAACAGATTTGG 233-251 0.718 R5TATGCTACATAGTATGTCCTCAGAC 不应用内含子进行连锁分析时，可用44/49，45/50两组双重PCR同时扩增，亦可在这些组中，将缺失热点的引物加入，形成多复PCR，连锁分机与缺失检测同时进行.五、DMD/BMD的PCR快速前诊断 过去DMD/BMD的PCR快速产前基因诊断主要采用RFLP连锁分析，由于该方法探作复杂费时，提供的信息量有限，因此不能满足临床诊断的要求，目前主要应用PCR法进行产前诊断.产前快速基因诊断常用以下两种途径 1.四步法: (1)性别确定.━━(SRY引物＋DMD课题内对照) (2)先证者缺失型基因检测(多重PCR) (3)胎儿缺失型的确定(多重PCR＋单对引物PCR) (4)Amp-FLP＋PCR-RFLP确定非缺失型式携带者 2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基础上建立了一步到位快速法，该系统包括以下三组多重PCR体系. ①5pmCA＋e12＋MP1P ②e17＋44CA＋49CA ③e17＋45CA＋50CA 应用上述三组多重PCR不仅可将女性的两条×染色体分开.而且能检出染色体的.另有一组，SRr＋e44定胎儿性别及44外显子的缺失.一步到位法快速，方便，它不仅能检测缺失，亦可对非缺失型的DMD/BMD进行连锁分析.
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