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的 PKU均因PAH基因的单碱基量换所致.目前在我国其检出了15种以上的点突变6见表,这 些点突变在我国南方和北方人群中的频率有的不同.因此在PKU的诊断中注意这种差别.中国人已检出的PAH基因点突变 突变位点代号 所外的外显子 突变性质 E56D 2 G→T R111X 3 C→T IVS4nt-1 4 G→A F161S 5 T→C Y204C 6 A→G R243Q 7 G→A G247V 7 G→T L255V 7 T→C R261Q 7 G→A IVS7n+2 7 G→T W326X 10 G→A A345T 10 G→A Y356X 11 G→A R413P 12 G→C T418P 12 A→C PAH基因点突变的PCR检测(一)PCR-ASO斑点杂交 在我国人群中,目前所发现的PAH基因突变以点突变为主,因此可以此来合成相 应的突变型寡核苷酸探针.来检测PKU患者的点突变,ASO法是最为有效的点突变检测 技术.随着非同位素标记探针的出现及反向斑点杂交的应用,预记该方法的临床应用 将愈来愈广泛.下表训列即为利用PCR-ASO检测时所用的引物.探针 突变位置及 性质 扩增 区域 引物 扩增 片段 突变探针 R111×(C→T) 3 F5GTTAGGTTTTCCT GTTCTGG3 300bp 35GAGCTTTCATGA GATAAGA3 R5CTTATGTTGCAA AATTCCTC3 35GAGCTTTCACGA GATAAGA3 Y204C(A→G) 6 F5CACAGGTTCTGG TCCCCGAC3 354bp 65TTGTACTCACAG CAAGCAT3 R5CTCTCCTCTCCT CAATCCTC3 65ATGCTTGCTATGA GTACAA3 R243Q(G→A) 7 F5CTCCTAGTGCCT CTGACTCA3 291bp 705TTCCGCCTCCAA CCTGT3 R5ACCAGCCAGCA AATGAACCC3 75TTCCGCCTCCGAC CTGT3 W326X(G→A) 10 F5CCCAGTCAAGG TGACACATA3 256bp 105ACAGTAAACTAG TAAAT3 R5ACAAATAGGGTT TCAACAAT3 105ATTTACTGGTTTA CTGT3 Y356X(C→A) 11 F5TGAGAGAAGGGG CACAAATG3 320bp 115CTACAGTAATGC TTATC3 R5GTAGACATTGAG TCCACTCT3 115CTACAGTACTGC TTATC3 R413P(G→C) 12 F5ATGCCACTGAGA ACTCTCTT3 245bp 125GGTCGTAGGGAA CTGAG3 R5AGTCTTCGATTA CTGAGAAA3 125GGTCGTAGCGAA CTGAG3 扩增时所用引物系根据每个外显子两侧的旁侧序列的设计.扩增片段包括完整的 外显子区域其两侧部分内含子序列.(二)3-碱基特异PCR,高位特异PCR 在以PCR为主的已知突变检测中,3BSPCR是最简便可行的一种检测技术.在应用 时,采用正常引物和突变引物两组试验,以确定何种引物可扩增,然后电泳确定有无相应的突变. 由个PAH各外显子间的距离较大,各自有独立的引物,因此可用多重PCR同时扩增数 个外显子.不应同时,可将正常引物编为一组,突变引物编为一组进行两组多渗PCR. 然后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物以确定突变位点. 表所到即为国内报道的用等位特异PCR诊断PKU后用的相物及扩增片段,检测位置 外显子 及位置 共同引物 正常引物 突变引物 C/N C/M 3, R111× (C→T) (CGA→ TGA) C:5TCTAGAC CTTCTCG-3 N:5-TTCTTCT TATCTCG-3 M:5-CTTTCTT CTTATCTCA-3 147 148 6, Y204 (A→G) (TAT→ TGT) C:5-AGCCCA TCCCTCGA-3 N:5-ATGTGAT TGTACTCAT-3 M:5-AATGTGA TTGTACTCAC-3 114 113 7, R243Q (G→A) (CGA→ CAA) C:5-CAGTAC TCACGGTTCG-3 N:5-GTTTCCGC CTCCGA-3 M:5-GGTTTCC GCCTCCA-3 138 137 11, Y356X (C→A) (TAC→ TAA) C:5-TCTCTG CCACGTAA-3 N:5-TGGGGCC TACAGTAC-3 M:5-TGGGGCC TACAGTAA-3 118 118 12, R413P (G→C) (CGC→ CCC) C:5-TACTGT TAATGGAATC-3 N:5-CCCTTCTC AGTTCG-3 M:5-CCCTTCT CAGTTCC-3 94 94 (三)用PCR直接检测发生点突变的内切酶点 在PKU已检出的突变位点中,有七个位点的突变改变了限制性内切酶的识别位点. 若用该酶切位点两侧的引物扩增包括内切酶识别位点在内的DNA的酶,然后将扩增产物用内切酶 溶解,通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切点段,以判定个体有无该内切酶识别位点的突变,引起内切酶识别 位点改变的点突变见 基因突变类型 扩增区域 内切酶 识别位点 突变结果 F56(G→T) 2 MnⅠ CCT(N) 消失 R111×(T→T) 3 BspHⅠ TCATGA 出现酶切位点 NLaⅢ CATG IVS4n+(C→A) 5 MaeⅠ CTAG 消失 DneⅠ CTNAG 新切点出现 G247V(G→T) 7 HaeⅢ GGCC 消失 W326×(G→A) 10 DdeⅠ CTNAG 出现新切点 A345T(G→A) 10 RsaⅠ GTAC 出现新切点 Y356×(C→A) 11 RsaⅠ GAC 消失 (四)新的突变位点的PCR筛查: 对于有患者,不够用上述的PCR方法检出其突变位点,则可用PCR-SSCP,PGGE、 CDGE及其它的突变位点筛查技术进行筛查,以确定检出的突弯位点与PKU的关系.PKUPCR诊断的途径 (一)利用PCR-ASO检测,近年来又发展了反向点杂交及非同位标记探针,与PCR-A SO应用起来更为方便,它是检测PKU点突变的最为手段之一. (二)利用等位特异PCR(ASPCR) 若将ASP-PCR与多重PCR结合,形成MASP-PCR则一见可检测多个突变位点,要是一 个非常有效的PKU诊断手段. (三)利用PCR-RFLP诊断 由于某些突变涉及到酶切位点的变化,因此右PCR-RFLP进行诊断PKU.PCR在PKU的产前诊断断中的应用 由于PKU的治目前沿无有效的方法,因此其产前诊断,防止PKU患儿的出生具有重 要的意义,在PKU的产前诊断中,RFLP是较为传统的诊断方法,操作费时,不能及时 提供临床诊断信息,而且有相当大的一部分不能提供信息加止还要用同位素标记的探 针进行操作,因而大大的限制了其原因,应用PCR技术诊断PKU快速准确,易于满足临 床需要,而是便于推广应用.(一),PCR-ASO 传统的PCR-ASO及类似的诊断方法尽管准确有效,但操作复杂,往往需要进行多 次操作,确诊一测颇为费时,近年来应用的反向点杂交法(reverse dot bolt RDD), 改变了传统的点杂交程序,因而该其检测时程明显缩短,操作也较简化.RDB是将一系 列的ASO探针先固定于膜上,然后用扩增的靶DNA与之杂交,在应用时,可将一些较为 常见的点突变探针固定于同一膜,而少见的固定于同一膜,因此结束分析样品最多只 需杂产两次即可完成PKU的诊断,在这种情况下,即使无证者一亦可进行产前诊断.(二)MASP.PCR 采用MASPPCR亦是进行已知PAU突变点基因产前诊断的简易方法之一.(三)AmPFLP+PCR-SSCP快速诊断 尽管采用PCR-ASO和MASP-PCR可检测全部的常见的PAH基因的已知点突变,但它只 能诊断约70~80%的PKU患者及浸入,仍有相当一部分不能同上述方法进行产前诊断, 我国董尚志等人利用PAH是国内的STP及VNTR作为多态性标记结合PCR-SSCP进行产前诊 断,其诊断的准确率可达90%左右诊方法包括以下几步. 1.Amp-FLP连锁分布:等用PAH基因内含子中-STR多态性进行分析,可次66.2%的家之获得有用的诊断信 息,其引物序列为:可扩增片段大小范围为,扩增完毕合用变性胶(尿素)PAG电泳分析 扩增长产物的片段多态性和先证者及携带者对照,确定胎儿的基因组合,以判断是否 为PKU患儿,若用连锁分析不能诊断则进入下步 2.外显子4PCR-SSCP 3.外显子7,11,12SSCP分析:通过上述3步分析,诊断常可达90%以上,该方法简使快速,准确率多,极适合于 基础应用.若将PCR-ASORDB与Amp-FLP联合应用,则定确率定高,况且要进行杂交,条 件及探治相对复杂,因此尚不够广泛推广于临床检测. < 1 > < 2 >
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