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； （2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变； （3）通过改变PCR扩增产物的大小或产物不能特异扩增来发现异常缺失； （4）通过对DNA多态性研究来间接诊断致病突变。最后，还将讨论PCR技术的技 术性难点、重要控制条件及局限性。产前基因诊断基础知识 产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978年Kan和Dozy提出应用 与β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种诊断需要进行家 族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋 白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没 有孩子，则调查夫妇双方的父母。到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以 直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷蛳xnNⅠ不能 在突变位点降解镰状β－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。这种 改进不需家族调查，就可更准确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使 直接而简便地确定致病突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。 单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。到1988年 底，我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型 血友病人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和-多囊肾病 人。应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血 有大多数Duchenne肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。 几乎所有这些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技术在产前诊断、症发 前诊断及携带者发现等方面具有非常重要的价值。应用PCR技术直接发现点突变 在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测 序。John Hopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：（1）将人绒 毛膜样品（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）应用 PCR技术在β珠蛋白基因5末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120。 （3）用CvnI酶消化725bp扩增产物。（4）降解的产物进行电泳。（5）EB染色。（6） 紫外灯下观察DN-段，并拍照。 在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。因此，酶解产物至少应可 见三条带。每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因 经酶结果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR扩增的产 物，而不是利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位置的β突变位置。然 而，这种方法的的局限性（也是Southern杂交的局限性）是不能显示包括第六密码子 即βS突变位置的β珠蛋白基因的缺失。因此，一个杂合子个体（含一个βS珠蛋白基 因，及一个基因缺失）与患镰刀状红细胞贫血病人（含两个βs珠蛋白基因）酶切片 段的条带图形是一样的。所以，在诊断这类病人时，会遇到一些困难，最后只有调查 其双亲才能确诊。如果双亲都是βaβs基因型，这个人可确诊为镰状红细胞贫血症。 如果双亲中一个一是βa型，另一个是βaβs基因型，此人诊断为βs杂合子基因型且 βs珠蛋白基因含一个缺失。由于突变引起的疾病具有一定特征，所以，理论上直接 确诊β地中海贫血是可能的。发生地中海贫血症的高危人群为地中海人、中东人、亚 州印度人、中国人和黑人。到1988年底，已知引起地中海贫血的突变有60多种，引起 地中海贫血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少 的种族中。因为每种人群有自己的β地中海贫血突变谱，一般情况下，4-6对等位基 因在任一特定种族的β地中海贫血基因中占99％以上，因此，使确定易患β地中海贫 血的夫妇二人的致病突变简单化。 β地中海贫血症突变 种族 受影响的限制性内切酶位点 无意义密码子39 地中海人 增加MaeI位点 IVS-1，nt6 地中海人 增加SfaNI位点（在 IVS-2，nt16上也是 多态性SfaNI位点 IVS-1，ntl(G-A) 地中海人 丢失BspMI位点 移码6 地中海人 丢失CvnI位点 IVS-2，nt745 地中海人 丢失RsaI位点 －87 地中海人 丢失AvRⅡ点 IVS-2，nt1 地中海人 丢失HphI位点 βe 中国人 丢失MnlI位点 无意义密码子17 中国人 增加MaeI位点 －29 中国人，黑 人 增加NlaⅢ位点 无意义密码子43 中国人 丢失HinfI位点 －88 黑人，印度 人 增加FokI位点 IVS-1，nt1(G-T) 印度人 丢失BspI位点 IVS-1，nt5（G-A) 阿尔上亚人 增加EcoRV位点 通常无子女的配偶双方更应检查，因为他们的红细胞比积及血红蛋白A2含量筛选 测试似乎具有β地中海贫血特征。其方法是检查夫妻双方是否含有所在人群中觉的等 位基因型。自1987年9月以来，在不利用DNA多态性和Southern分析方法情况下，在各 种簇中我们在产前明确诊断了80例地中海贫血病人，所有这些诊断是通过直接确定夫 妇及其胎儿的突变获得的，此方法通常需要把打点杂交与限制性内切酶分析法结合起 来。需进行基因组序列分析的情况很少。60种地中海贫血的等位基因突变型的一半以 上类型可以通过扩增产物酶切分析方法查明。对于地中海地区的夫妇，通过这种方法 可以分析无意义密码39，移码6，IVS-2，nt-1，IVS-2，nt745，IVS-1，nt-6及-87。其 余在地中海人中常见的突变，IVS-1，nt110，IVS-1，ntl和移码8全由打点杂交发现。 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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