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通过一个富含GC片段与有两个解链区域的 DN-段结合来解决这一困难，富含GC的片段我们称之为GC发夹。当缺乏GC发夹时， 只有那些发生在此DN-段第一个区域所发生的单碱基变化可用DGGE分开;而GC发夹与 该DN-段结合能够区分第二区域所发生的单碱基改变。\par我们对GC发夹的研究最 初是通过将突变的DN-段克隆入一个质粒载体，使其与一个含80%鸟嘌呤与胞嘧啶的 300bp片段连接，并用限制性内切酶隆解此克隆DNA，使之释放出与GC发夹结合的靶片 段。虽然该方法是行得通的，但是要设计一个适合于直接检测基因组DN-段、特别 是带有长达300bp的GC发夹的片段仍然存在着困难。克服这个困难的第一步是有关的 实验观察以及理论推算，结果表明GC发夹长为30bp就足能用于绝大多数DN-段的 DGGE分析。第二步进展在聚合酶链反应(PCR)基础上，设计一方法使短的GC发夹与DNA 基因组结合。该方法是根据一篇报道，即有限制性内切酶位点的DNA短片段能够与寡 核苷酸相连，此寡核苷酸用于PCR扩增DN-段;这些在DNA基因组织中未编聯的寡聚核 苷酸的wè5尾斣陂织PCR过程中有效地掺入扩增的DN-段的5末端。我们最近将该原 理用于DGGE方法，结果表明长40-45bp的GC发夹能够与来源于人基因组的扩增DN-段 结合，此GC发夹能检测发生单个碱基变化的DN-段，而当其缺乏GC发夹时，DGGE检 测不到。PCR扩增过程中DN-段的大量扩增增加了灵敏度，所以只需少量DNA样品， 经EB染色的DNA可以很容易地检测出来，因而不需使用放射性探针。因不需与放射性 探针杂交，此法也能比较容易地检测低、中和高拷贝数的重复序列，而这些序列用 Southern杂交来分析有时是十分困难的。在此将详细描述本方法的实验过程，并且专 门讨论该方法如何用于完整的从短到中等长度的基因的分析。策略 利用PCR扩增基因组或者克隆的DNA样品，两条寡核苷酸链与DNA的两侧相结合。 其中一条链的5末端附加40-45nt的GC富含序列;该5末端结构在PCR过程中掺入扩增 的DN-端的5末端。扩增的DN-段在对待测DNA浓度合适的变性剂梯度胶中电泳， 凝胶用EB染色、紫外检测。因突变或中性多态性而具有一个碱基差别的DN-段在凝 胶中迁移到不同的位置，经EB着色呈现不同的带。 在开始使用PCR/GC发夹方法前有几个方面需予以考虑。如下面将要讨论的，尽管 可用DGGE检测和1000bp的DN-段，但该方法检测500bp和更短的DN-段更为有效。 在PCR扩增以及DGGE过程中，可用几种不同的方法来选择寡核苷酸以达到最佳实验结 果。此外，有三种不同的方法来决定对于每个扩增DN-段最佳的变性梯度以及电泳 时间。寡核苷酸的设计 在使用PCR/GC发地，必须选择用来扩增靶DNA的两个寡核苷酸。一般扩增最好是 选择长度在100-500bp之间的DN-段。之所以选择范围的DN-段因为用DGGE检测长 于500bpDN-段时，突变型和野生型分子之间的分辨率会下降;此外，超过几百个碱 基对的DN-段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动非常缓慢，走电泳的时间太长，因此用 PCR/GC发夹的方法来检测几个kb的全基因，我们建议设计几对寡核苷酸将此基因扩增 成几个带有重叠的DN-段。虽然用PCR可同时扩增多个片段，但扩增临近片段时应小 心避免产生不必要的复合体产物。因此，为了达到最理想的结果，每一对引物应分别 用于不同的PCR反应。但是通常可根据DN-段的解链特性在DGGE之前、PCR扩增之后 将两个或多个片段混合，只用单孔胶分析多个片段。 根据DN-段的核苷酸序列[6，7，14，15]，有可能推知它的解链特性;并且根据 推论选择寡核苷酸的位置以便合成适合于DGGE的DN-段。当然，也可以简便、有效 地选择靶片段而不用推知解链特性，选择扩增DN-段的寡核苷酸并且在PCR扩增后选 择最佳的DGGE分析条件。下面将提供有关使用上述简便方法的具体建议: 1.选择两个相对长度为20-25nt的核苷酸序列作为特异的引物通过PCR合成靶片 段。理想的引物核苷酸序列应该最少有50%G+C，并且不应该有间接重复序列。 2.设计两个PCR引物，其中一个有额外的40个100%G+C核苷酸附加在5末端作为GC 发夹。解链推测以及我们的经验表明任何随机的GC序列都能达实验目的。当然有几个 建议可以避免一些问题。避免在GC发夹序列中的重复延伸，此重复结构在PCR过程中 形成干扰引物与模板退火的二级结构。同时在设计的GC发夹引物中，最好C碱基经G碱 基要多，并且使引物中的连续的G碱基减至最低。之所以如此，是因为寡核苷酸合成 仪合成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。之所以如此，是因为寡核苷酸合成仪合 成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。只要每个PCR反应分别进行，在每组引物中利 用相同的GC发夹序列都能得到满意的结果。我们曾用6个不同的GC发夹序列成功地扩 增出了几个不同的DN-段。其中一个序列如下所示: 5CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCC 3 该序列在3末端接上长20-25核苷酸特异序列，此序列可与基因组DNA中的靶片段 区退火。虽然我们在该GC发夹中间加入了一个T碱基，因其会使Tm值降低，所以建议 不要采用此形式;我们建议使用含100%G+C的发夹，发夹顺序如上所示或类似。根据序 列的解链计算以及我们使用6种不同的GC发夹的经验，表明一个长40核苷酸的发夹最 为有效。因此超过该长度的发夹就没有必要。虽然短于40核苷酸的GC发夹与一些DNA 片段结合也有效，但它们对其他一些片段就不那么有效;因此，我们不主张使用少于 40个核苷酸的GC发夹。 3.对于大多数DN-段，只需在其中一个的末端具有单一的GC发夹。有关的解链 预测以及某些实验表明GC发夹附着于DN-段的两个末端并增加在DGGE上识别碱基的 分辩率。虽然我们还未扩增用两个分别含不同的GC顺序的寡核苷酸来扩增长达1000bp 的DN-段，但仍有可能办到，然后用限制性内切酶消化扩增的DN-段使其酶切位点 差不多位于DN-段的中间位置，产生两个含GC发夹的片段。使用该方法可能存在的 问题在于两个GC引物在PCR过程中可能彼此干扰。 4.我们用变性的聚丙烯栈腕凝胶电泳纯化用于PCR的寡核苷酸引物;然而有些纯化 对于特异制备的引物可能是不必要的。因为含有GC-发夹的引物至少长60个核苷酸(40 个核苷酸的GC发夹与长20个核酸的特邓列结合)，制备物通常含有干扰PCR结果的较短 寡核苷酸;这些片段很容易经制备电泳而除去。纯化之后，引物要经过酚抽提乙醇沉 淀及TE缓冲液悬浮(10mMTris.HCl.pH8.0，1mMEDTA，)，使其终浓度达10pmol/μl聚合酶链反应 现已报道用多种不同条件通过PCR扩增DN-段，现归纳如下。当对哺乳动物DNA 进行实验时，我们用的反应总体积为50μl，内含50-500ng基因组DNA。反应缓冲液: 67mM Tris.HCl，pH8.8，6.7mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，10mMβ羟基乙醇和10%二甲 基亚砚。反应液同时分别含有75pmol四种脱氧核苷三磷酸、每一种寡核苷酸引物为 50pmol。混匀样品后，加入一个单位的Taq DNA聚合酶，100μl矿物油覆盖于反应溶 液的上层以防蒸发。反应样品于93℃保温1分钟使DNA变性，然后如下所述在60℃到 70℃之间放置1-2分钟。扩增后，将水相转入另一支试管，酚抽提及乙醇沉淀。用 50μl非变性胶载样缓冲液悬浮DNA。在PCR扩增过程中出现的一些问题以及建议如下 A.错误的PCR扩增片段:使用简便的EB染色检测在变必梯度胶中的扩增DNA，经PCR 扩增应该合成单一的DNA。不幸的是反应产物偶尔比预料的要复杂得多;例如形成除靶 DNA之外的许多不同大小的DNA，有时这些非靶DN-段占产物的绝大部分。在此情况 下，额外产笺DNA干扰了在DGGE上对靶片段的分析。我们采取以下几个步骤为防止上 述问题的出现: 1.在PCR过程中避免产生非靶DN-段的方法之一是使反应在尽可能高的温度下进 行。反应在低温下(45-55℃)退火有可能使引扩增基因组DNA上的其它区域而不是靶片 段。很可能引物不能完全与非靶DNA序列互补，但经PCR最初合成反应之后，这些新的 产物在随后的扩增循环中成为退火良好的模板。因此，我们一般在尽可能高的温度下 退火，通常是55-65℃，然后在可能的最高温度下延伸，一般为60-72℃。对于每一对 寡核苷酸温度的选择是根据经验来决定的。 2.选择比较长的寡核苷酸引物(25-30个核苷酸而不是20个，不包括GC发夹序列) 有时能改善反应的特异性，减少非目的产物。较长的引物同时可增高退火/延伸的温 度，而这也增加了反应的特异性。实际上，30个核苷酸长的引物在PCR过程中可直接 在两个温度之间(通常是70-72℃和93℃)进行循环反应，而不需要通过退火步骤，从 而有助于防止非物异的带产生。 3.在有些情况下进行PCR，即使在较高的温度下反应，多余的带也会出现。这可 能是所使用的寡核苷酸与基因组中相同或相似的序列退火，而这些区域可能是低．中 或高拷贝数的重复序列。解决这一问题的最简单的方法是合成新的寡核苷酸来扩增与 最初选择稍有不同的片段。由于合成寡核苷酸成本昂贵，我们建议两个引物中仅改变 其中的一个引物（无GC发夹的那个引物）。如果这一方法有来检测DNA重了列所发生 的碱基变化，通过使用与重复区域以外序列杂交的寡核苷酸进行扩增就可避免这些问 题。 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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