个体配子DNA序列的PCR分析

的研究加上适当的统计学方法可推知形成合子的减数分裂产物的重组或非重组的性质，同时可以估计重组在减数分裂中所占的比例。我们研究遗传重组的方法与上述的不同，它通过分析减数分裂产物本身的DNA来决定减数分裂发生重组的比率。每个男性一生中可产生大量的减数分裂产物精子，从而提供了进行遗传分析取之不尽的实验材料。　　假设一个男性杂合子有两个连锁基因座。每一个基因座的多态性差异在于AT-AT 或GC-GC)要么是重组型(AT-GC或GC-AT)。重组类型出现的频率将取决于两个基因座彼此间的遗传间距。通过检测某一个体的大量精子，可精确地计算出四种精子类型出现的频率。该技术存在的困难在于确定减数分裂前细胞中的每个基因座上存在的两种等位基因中的哪一个进入单个精子。常规的分子生物学技术没有足够高的灵敏度分析精子染色体DNA的单个分子。　　PCR扩增每个基因座的多态性区域是分析精子的第一步。两个基因座用两组引物，同时引物必须位于多态性区域的边侧。当精子两个靶序列经PCR扩增，就确定了每个基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探针可识别等位基因小到仅发生单个碱基置换的实验方法已得到改进，这些等位基因牧场划的寡聚物（ASO）探针第一次应用是将人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因与镰刀形红细胞（βA）的突变区分开来。本方法检测等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的长19bp)。每个寡核苷酸与一个等位基因完全互补而与另一个等位基因通常只有一个碱基的差别。同位素标记的寡核苷酸分别与待检测扩增的DNA样品杂交。在适当的杂交条件下，只有样品中的序列完全互补时，寡核苷酸可形成稳定的双螺旋。例如，精子的 PCR产物用四种ASO探针分析。有一对ASO分别将基因座1的两个等位基因区别开，另一对将基因座2的两个等位基因区别开。实际上，预期两个ASO中只有一个与某一个减数分裂产物杂交，可以确定每个检测的精子对于所研究的染色体而言实际上是单倍体。　　人单倍体细胞有1.5-5X10-24摩尔单一DNA序列。根据以前的实验结果，我们知道活性达5μCI/微微摩尔的同位素标记就能够在不到一天的时间内检测出1毫微微摩尔（10-15/10-24）。即使以较低的平均扩增效率，大约经50个扩增循环便可完成。单个细胞的PCR分析单个二倍体细胞　　在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交强弱各不相同；19个与βA探针．12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗示转入到反应管中的单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。　　单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时，一个二倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以平均效率65％计算，经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×1010倍。考虑到扩增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。单精子的分析共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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