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就是讨论这些步骤。用引物标记PCR产物 用γ-32P-ATP直接将一个PCR引物磷酸化(Kinasing reaction)，然后在标准PCR 反应中直接使用标记的引物来扩增出一端带有标记的片段。将这种末端标记法应用到 通过Maxam-Gilbert或磷酸硫代化学法对产物进行直接测序，以及合成一些适用于进 行蛋白质的结合/保护分析(binding/protection assays)或“足迹法”的DNA序列。PC R技术是一种在体外合成用于蛋白“足迹法”分析所需DN-段的简便方法。蛋白“足 迹法”分析不依赖限制性内切酶位点并且比限制性内切酶位点并且比限制性内切酶片 段的分离和末端标记更为简便。 生物素可以标记到一个寡核苷酸引物的5-末端上，其结果并不影响PRC反应。这 为用抗生蛋白链菌素─或抗生物素蛋白─酶共扼物检测杂交PCR产物提供了一个非同 位素法，它还可以用抗生蛋白链菌素柱(Streptavidin─columns)将产物的一条链与 另一条链分开;此外，它还可以对PCR产物进行定量。同样，也可制备用荧光标记的寡 聚物并应用在PCR技术中。带有不同荧光标记的特异性引物可以区分从不同位点扩出 来的PCR产物。在PCR产物的末端导入有用序列 如图1所示，内切酶的识别位点可被加到单个或两上PCR引物的5端上。这些位点 有助于扩增片段插入到克隆载体中。在扩增产物的两端加上不同的酶切位点，产生的 特异性的粘性末端就可直接进行克隆转化。在设计“添加”内切酶位点的序列时，最 好在标准识别序列的5末端另外再多加几个碱基，以免处于片段最末端的酶切位点可 能不被内切酶所识别。文后的操作指南A就是关于将PCR产物的这种位点上进行酶切， 并用连接酶将产物插入克隆载体的操作步骤。用这种方法加到PCR片段的其他序列还 有RNA聚合酶的启动子。这些富含G+C序列是为了增强变性梯度凝胶电泳的分辩力，以 使它能区别出单碱基差异的不同片段。由PCR产生的突变和重组 Mullis等指出PCR技术可以用来“装配”重叠寡核苷酸使之成为很长很长的PCR产 物，从而获得比用直接化学合成法具有更多产量的全合成DNA模板的两年PCR产物准确 地连接起来。如图二所示，从同一模板的不同区域扩增出来的两个PCR产物，经过这 样处理后，得到的片段在序列上能相互重叠。这些产物可经过混合，变性及退火。在 异源双链中有一条链在3-末端发生重叠，利用与其5-末端配对的引物，来扩增这个 异源杂合双链，我们就可以从由两上次级PCR产物准确地连接成的片段混合物中调出 一个片段(按Mullis的说法)。由于特生的扩增，PCR反应中的绝大多数产物是我们所 需的重组DN-段。 通过引物导入的序列变异因化学合成的引物长度有限而受到限制，但此法与PCR 片段连接法组合使用，可在片段的任一位置引入变异，而不仅仅是在其末端引入。重 组所需的重叠序列不必存在于天然模板，可设计成添加序列进入引物。这样，通过 PCR技术几乎可在DN-段任何位置上特异性地进行位点替代、缺失和插入，同时它还 可以将本来毫不相关的序列准确地连接起来。 图二.位点特异性突变和利用序列重叠来组合PCR片段。箭头表示靠近于它们在靶 DNA序列退火位点上的寡核苷酸引物。两个中间或叫内侧引物与靶序列有一个碱基错 配，它们退火到靶DNA链的同一部位，但引发合成的方向相反。错配导致了在两个初 级PCR产物中发生同样的序列变异。PCR1和PCR2是分别进行的，产物从过量的引物中 分离出来，然后混合，变性再退火。有些分子如图所示通过中间引物的重叠而重组。 带有内陷3-末端的DNA链的重组体的延伸将产生一个可以用原来的外侧PCR引物扩增 的分子，这两个引物可调出在远离其末端有一个特异性碱基变异的DNA分子。 图三.由PCR产生插入、缺失和序列重组。A:互补的两个引物，可以用将一小段插 入序列带入两个重叠PCR片段的末端。(插入子由环状表示，注意:如图所示:插入序列 不一定于引物的5-末端。)如图二所示:可通过组合两个重叠的PCR片段，将插入子序 列可通过PCR合成一完整插入片段，将其与两侧的PCR片段连接，如(C)所示。B:通过 重组重叠PCR产物，重叠引物可使靶基因上的一段序列丢失。C:重组PCR法，毫不相关 的PCR片段，可以通过在5-添加互补重叠序列而重组在一起。重叠PCR片段的组合如 图二所示。 这些过程详见图二、图三。图二显示了以错配的形式在引物和靶序列之间引入一 个特异性的替换碱基。通过使用重叠PCR，这个替换的碱基就被移到DN-段的中央。 图三A显示了将一个小插入片段作为添加序列加到引物上。在这个方案中，插入子的 大小受到引物长度的限制。不过要获笪长的插入片段，可先把完整插入序列做成一个 PCR产物，然后通过重叠引物使之与边侧序列组成。图三B图示了可用来产生缺失的重 叠引物。图三C表明重叠添加序列是如何将一个假定的启动子结合到基因序列上的。 将不同的序列组装丐来的PCR技术称为“重组PCR”，该方法详见操作指南B。 有报道用这种PCR方法可将替换位置于300-800bp的PCR片段的中间部分。Vallette 等也报道了用添加序列的方法来获得插入和缺失。Horton等准确地将四个不同序列重 组最终产生一个970个碱基的DN-段，该片段编码镶嵌型小鼠第一类MHC蛋白。Hortor 称这种方法为SOE，或重叠延伸拼接法(Splicing by Overlap extension)。 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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