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性高于一般的PCR. 连接酶链反应 连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增. 连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利.1988年Landegren也进行了该项研究.1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验.耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序. LCR的基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DN-段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.其程序为:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物. LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20～26个，以保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高. LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性和65℃复性并连接，循环30次左右.其产物的检测也较方便灵敏.目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等. 依赖核酸序列的扩增 依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又称自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成. NASBA反应体系中除含有上述三种酶外，还含有dNTP，NTP(核糖核苷)，两种特殊的引物和缓冲液.引物I3末端与靶序列互补，5端含T7RNA多聚酶的启动子，这一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5未端互补. 在NASBA反应时，首先引物Ⅰ与RNA模板复性(结合)，AMV逆转录酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5未端结合，逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的RNA链，而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA. 其基本方法为:将引物，标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打开，降温至37℃加入逆转录酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反应1～1.5小时，其产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带.NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高，其扩增效率高于PCR，特异性好. 转录依赖的扩增系统 转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA. 合成A、B引物，引物A的3末端与待扩增RNA互补，其5端有T7RNA多聚酶的启动子信息.逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3端互补合成cDNA第二链.逆转录酶除具有逆转录活性外，还有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此双链DNA为模板.转录出与待扩增RNA一样的RNA，这些RNA又可作为下轮反应的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高，一个模板可转录10～103个RNA拷贝，因而反应液中待检RNA的数量以10的指数方式扩增. TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2×106.它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高.虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和T7RNA多聚酶，有待进一步研究. 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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