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平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。 粘端连接 引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI
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