PCR产物克隆方法

I等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度，而且酶切效果优于5加端法。对于特定DN-段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5加端法更为适宜。T4DNA聚合回切产生粘端　　如PCR两引物的5末端是A或T，则可在其5端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3→ 5外切酶活性而消去3末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。此DN-段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5端加2—4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。T－vector法　　TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3末端各加一处胸苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3末端突出一个胸苷的T尾载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3末端加上一个胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平端载体DNA分子的两个3末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector 的不同之处在于前者3末端不能与待克隆PCR产物的5末端连接，仅 5末端可与PCR产物的3末端形成磷酸二脂键。　　共环消解法：最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化连接反应，使5端带有限制酶切位点的扩增DN-段连接成共环结构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DN-段。对于对称性限制酶位点，只需在引蛾的5末端加上一关识别序列，因为在串接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。无连接酶亚克隆法(A)　　无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两端分别互补的碱基。两引物的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补，5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同，PCR片段可以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。　　由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后，分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引物，与紧邻5’端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上游引物，与紧邻5’附加序列内侧的质粒（-）链互补。　　第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复性产物（这种复性产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通过各自3’ 端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时，重叠的3’端互为此物沿各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的“连接”。然后两管中PCR扩增各进行15—20个循环。这便可产生大量一端管1）或另一端连接有PCR插入片段的质粒。　　第二次PCR后，将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物，除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异源双链DNA，并各自有一较长的5’或3’悬端，这种长的5’或3’悬端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。　　尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠直杆菌。一旦进入体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体中为例说明LFS法。　　这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR时两引物的5’附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成，引物二聚体，一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达 1.7kb的基因片段。这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行亚克隆的片段；②适于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目的（如含点突变、缺失或插入等）片段；④在某些情况下，对已构建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适位置；⑤较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。　　DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着 PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。
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