荧光 ELISA 两种荧光底物和一种显色底物的比较

thyl-benz-thiazoline sulfonic acid （ 6 ） ] （ HRP ）、 3 ， 3’ ， 5 ， 5’-tetramethylbenzidine （ HRP ）、 ophenylenediamine （ HRP ）、 p-nitrophenyl-phosphate （ AP ）和 o- nitrophenyl- β -Dgal actopyranoside （ β-gal ）、 chloro-phenolic red – β –D-galactopyranoside （ β-gal ）以及 NADP glucose6-phosphate 。显色反应与荧光免疫分析步骤比较近年来，开始对酶联类型的反应要求具有更高的灵敏度和灵活性。这就导致出现了许多不同的放大系统，例如使用基于生物素－亲和素以及生物素－链霉亲和素复合物的系统以及包括 HRP 和 AP 酶的抗体的使用。尽管基于生物－链霉亲和素系统也许在许多情况下更有优势，但是我们发现这一系统需要依赖多个抗体，而且不能显著地弥补固相免疫分析在延长时间时可能会增加的背景水平的缺点，在许多事例中，还存在放大非特异性结合的风险（ 6 ）。另一种提高灵敏度的方法是基于使用微孔板的荧光分析（ 7-9 ） . 。当前有许多荧光底物可以用于进行此类分析。这些底物包括 p -hydroxyphenylacetic acid （ HRP ）、 3- （ p -hydroxyphenyl ） propionic acid （ HRP ）、 4-methylumbelliferyl phosphate （ AP ）、 4-methylum belliferyl- β -D-galactopyranoside （ β-gal ）、 fluorescein di- β -D-galactosidase （ β-gal; 参考文献 10 ）、 4-methylumbelli-feryl- galactoside 6-sulfate （ β-gal; 参考文献 8 ），以及最近出现的 3 ， 6-fluophosphate （ FDP; Molecular Probes ， Inc.; 参考文献 9 ）。出人意料的是，尽管预测的荧光酶底物应该有着比显色底物高 10 － 1000 倍的灵敏度，但目前为止报道的最高的灵敏度增长只是接近 10 － 50 倍（ 2 ， 9 ）。一个例外的报道是与 β- 半乳糖苷酶直接相连的一抗可以明显的将抗原检测的极限降低 200 倍。因此，这种结果理论上的荧光检测灵敏度比显色检测高 1000 倍的可能性也许只存在于直接而非间接 ELISA 中。在此，我们使用 Tecan GENios Plus 和基于生物素－链霉亲和素系统的 ELISA 方法比较了显色和荧光检测抗体－抗原结合物的方法，方法步骤用杂交瘤方法得到鼠的单克隆抗体 HC484D1 和 HC490D11 （均为 IgG ）。微孔板（ 96 孔， GREINER ）用溶于 0.05 M 碳酸氢钠缓冲液（ pH 9.60 ）的 0.07-1000 ng 的人 Cartilage Oligomeric Protein （ COMP ）包被， 4 ℃ 过夜。然后用 PBS. 洗涤微孔板，再用溶于碳酸氢钠的 1% 的 BSA 室温孵育 2 小时。接着用抗 COMP 的一抗（ 1:100 ）室温孵育 1 小时。随后，微孔板再用 PBS 清洗，并用溶解在 PBS 中的标记有生物素的羊抗大鼠的二抗和链霉亲和素 - β - 半乳糖苷酶室温孵育 1 小时，浓度均为稀释 100 倍。显色反应的步骤与这一样，只是在用 HRP- 链霉亲和素孵育后，酶联反应再用 2’2-azino-di[3-ethyl-benzthiazoline sulfonic acid （ 6 ） ] 显色。光吸收值在 405nm 处读取。结果和讨论我们考察了 ELISA 法检测两种抗人 COMP 单克隆抗体的检测极限，以便对人软骨相关疾病病人（多为风湿病和关节炎病症）的血清和滑液中的完整或断裂的 COMP 进行监测。为此，基于显色法和荧光检测方法的间接 ELISA 方法被用于比较。剂量依赖曲线由不变的抗体浓度和减少包被的人 COMP 的方法确定，结果证明了在 50% 的抗体结合时（图 1 ，左侧），抗体 490D11/A4 比抗体 484D1/D6 的检测效率要高 5 倍。假设在低浓度时 100% 的蛋白都被吸收到了酶标板上，那么采用 ABTS 作为底物进行显色法检测时两种抗体可检测的 COMP 的量分别为 >3.9 和 >15.6ng （图 1 ，左侧）。相应的使用 FDG 作为荧光底物得到的检测 COMP 的量为 <0.5 和约 1ng （图 1 ，右侧）。但是，如果使用 HRP 的底物 MUG 检测，检测极限可以进一步降低几乎一个数量级，到达 <0.1ng 。这些数据证实了荧光 ELISA 比传统的显色法有着更高的灵敏度，并且与以前直接比较显色法的 AP 的 p -nitrophenyl phosphate 和荧光 FDG 底物得到的数据相一致（ 9 ）。在间接 ELISA 方法中使用 MUG 大约可以比使用通过酶与抗体复合物进行的直接 ELISA 法的灵敏度要高大约 200 倍（ 7 ）。以前的研究同样表明荧光 HRP 底物 3- （ p hydroxyphenyl ） proprionic acid 可能比采用显色底物 3 ， 3’ ， 5 ， 5’-tetramethylbenzidine 和 ABTS 间接 ELISA 要高 2 － 4 倍，而 AP 荧光底物 4-methy lumbelliferyl phosphate 要比显色底物 phenolphtalein monophosphate 和 p -nitrop henylphosphate 要高 6 － 13 倍（ 11 ）。后者这些灵敏度的提高仍然要低于早先报道的结果，也同样低于我们在此使用的 β- 半乳糖苷酶荧光底物 MUG. 。这结果表明，当采用优化条件时， β-gal-MUG 检测系统也许能在 96 孔或 384 孔上提供理想的固相免疫分析方法。此外，由于此体系是基于 β-- 半乳糖苷酶的，它可能在检测人体的体液、自身细胞和组织样本时具有特别的优势，这是因为内源性的 AP （也有可能有 HRP ）会产生非特异性的反应。荧光读取方式的灵活性对于比较不同反应的剂量依赖曲线时是特别有用的。传统的显色方法中，这种分析因为两个原因有时并不能顺利的进行。第一个就是酶的自发直接反应（ HRP 尤其明显），这在检测时间延长时会显著得增加背景水平。在本文中使用 FDG 和 MUG 即使延长反应时间到 24 小时，我们也未检测到有非特异性的反应产生；第二，延长反应时间或是仅仅由于免疫反应过强，也许会导致产生传统酶标仪读数上限的数据，例如信号超出范围（图 1 ，右侧）。这明显的后果就是无法得到剂量依赖曲线。通常来说，反应的动力学曲线可以用于检测抗体 —— 抗原反应的动力学。图例说明： • 左侧：用鼠抗原和酶底物显示的荧光 ELISA 。曲线 "MUG" 和 "FDG" 代表了没有一抗存在时荧光的水平。 • 右侧：采用 HRP 底物 ABTS 和相同浓度范围包被的人 COMP 得到的显色 ELISA ，在 450nm 处测得光吸收数据。主观的认为 OD 值＞ 3 为超出了测量的范围。点线显示了在没有一抗时光吸收的水平。参考文献（ 1 ） ENGVALL E. ， and PERLMANN ， P .: Enzyme-linked immuosorbent assay （ ELISA ） .Quantitative assays of immunoglobulin G. Immunochemistry 8 ， 871-874 （ 1971 ） . （ 2 ） PORSTMANN T. and KIESSIG S.T.: Enzyme immunoassay techniques. An overview. J.Immunol. Meth . 150 ， 5-21 （ 1992 ） . （ 3 ） KEMENY D.M.: Titration of antibodies. J. Immunol. Meth . 150 ， 57-76 （ 1992 ） . （ 4 ） JENKINS S.H .: Homogeneous enzyme immunoassays. J. Immunol. Meth . 150 ， 91-97 （ 1992 ） . （ 5 ） AVRAMEAS S.: Amplification systems in immunoenzymatic assays. J. Immunol. Meth . 150 ， 23-32 ， 1992 ） . （ 6 ） PESCE A.J. and MICHAEL G.J.: Artifacts and limitations of enzyme immunoassays. J.Immunol. Meth . 150 ， 111-119 （ 1992 ） . （ 7 ） L?RKFORS L. ， and EBENDAL T. : Highly sensitive enzyme immunoassays for a-nerve growth factor. J. Immunol. Meth . 97 ， 41-47 ，（ 1987 ） . （ 8 ） HUIQUAN Z. ， van DIGGELEN O.P. ， KLEIJER W.J. ， and L. PU .: Enzymatic diagnosis of Morquio A syndrome with a new fluorometric susbstrate. Chin. Med. Sci. J . 6 ， 9-13 ，（ 1991 ） . （ 9 ） HUANG Z. OLSON N.A. ， YOU W. ， and HAUGLAND R.P .: A sensitive competitive ELISA for 2 ， 4-dinitrophenol using 3 ， 6-fluorescein diphosphate as a fluorogenic susbstrate. J. Immunol. Meth . 149 ， 261-266 ，（ 1992 ） . （ 10 ） BARUCH D. ， GLICKSTEIN H. ， and CABANTCHIK ， Z. I.: Plasmodium falciparum : Modulation of surface antigenic expression of infected erythrocytes as revealed by cell fluoresence ELISA. Exp. Parasitol . 73 ， 440-450 ，（ 1991 ） . （ 11 ） ROBERTS I.M. ， JONES S.L. ， PREMIER R.R. ， and Cox J.C: . A comparison of the sensitivityand specificity of enzyme immunoassays and time-resolved fluoroimmunoassays. J. Immunol.Meth . 143 ， 49-56 ，（ 1991 ）
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