微孔板荧光技术研究噬菌作用

Molecular Probes）或自己标记的特殊粒子； • 活化试剂可以采用来自 Molecular Probes的标准BioParticle特异性试剂。也可以采用由实验人员自己提供的天然的或人工合成试剂； • Tecan Genios Plus 多功能酶标仪 ——可以使用所有规格的微孔板（标准板和高密度格式）测试步骤本实验采用 Molecular Probes 的 BioParticles ，其来源是 Zymosan A ， Escherichia coli 和 Staphylococcus aureus ，这些粒子都用荧光基团 BODIPY 、 Fluorescein 、 TRITC 和 Texas Red 标记。未标记的 BioParticles 也来自 Molecular Probes, Inc. 以用于实验对照。第一步是要先作出一条标准曲线，方法是将一系列浓度梯度的荧光标记的 BioParticles 放入空的微孔板中，并计算不同浓度的粒子发射出的荧光。细胞然后种植到 96 板上（ GREINER 或 COSTAR 96 孔透明板），直到其牢固地粘附在孔板的底部。接着向部分微孔中加入由 Molecular Probes 提供的 BioParticles 特异性（ IgG ）的活化试剂。再将由以前经验值确定的最大浓度的标记和无标记（对照） BioParticles 添加到微孔中。另一种方法也可以使用同源血清或者是其它想使用的活化试剂。按习惯的时间段在 0 到 90 分钟的时间内监测噬菌过程，实验在 37℃ 和 4℃ 进行，以确定特异性（ 37℃ ）和非特异性（ 4℃ ）的摄入量。噬菌过程的相对强弱自动由标准曲线推导计算，并减去 4℃ 时得到的非特异性摄入值。健康和病理人外周分叶核白细胞（ PMN）的噬菌作用实验中将大鼠的巨噬细胞 J774 用于模型实验，这是因为其有良好的噬菌效率，可以用来比较商品化试剂与从健康供体和病人中得到的血浆对噬菌作用的活化作用。然后，通过右旋糖苷沉淀分离来自健康-自愿者供体或者是来自糖尿病人（ PMN － D1 ）以及实验对象用皮质类固醇进行处理（ PMNC2 ）后的肝素化血液的 PMN 。得到的富含白细胞的血浆在离心机上进行分层，以 800g 离心 20 分钟。沉淀的细胞中，包含有颗粒白细胞和一些红血球，用含有 0.2%BSA 的 Hanks 平衡盐溶液（ HBSS ）洗涤。在剩余的红血球溶解破裂后，将 PMN 悬浮液种植到微孔板的一个孔里，密度为 3x105 细胞／孔，然后在 37℃ 孵育 30 分钟。未附着的细胞用 HBSS 洗三次以去除干净。在 4℃ 和 37℃ 时，将荧光粒子分别在不同的时间点进行添加。把培养物放到冰上以终止噬菌反应，然后用冷的 HBSS 清洗细胞三次以去除所有未能与细胞发生联系的粒子。噬入的粒子的数量用早先做出的标准曲线进行推导。图一总结了得到的结果。在所有的实验中，人 PMN 摄取 TRITC 的数量在孵育 60 分钟后达到饱和。因此，这种方法满足体外噬菌作用研究的可靠方法的标准：即在低温时吞入受到抑制，减少加入的粒子的量可以减少孵育时间。正如所证明的一样，此种方法也允许一些将 PMN 按照其噬菌能力的不同进行分类（在健康的供体上，可以分为 PMN － H1 和 PMN － H2 ），并可以评估从病人体内得到的 PMN 噬菌细胞缺陷的严重程度。自然地，这一系统对于确定天然和人工合成的试剂，包括从患病个体得到的血清在噬菌过程中的作用也是有用的。结论我们描述了一种快速地可重复的和灵活的基于荧光的研究噬菌作用的方法，它可以方便而准确地在微孔板上进行。这种方法拥有无摄入细胞计数、无放射性检测和允许跳过一些检测荧光物质的其它方法的优点。此外，此方法具有高度的可重复性，可以进行较少的细胞定量，而且不需要复杂的显微镜或荧光检测设备。此方法在基础科学的噬菌学研究领域具有适用性，也能用于在临床上研究先天以及后天的噬菌缺陷。参考文献（ 1 ） ODA ， T. ， & MAEDA ， H.: A new simple fluorometric assay for phagocytosis. J. Immunol. Methods 88 ， 175-183 （ 1986 ）（ 2 ） RAGSDALE ， R.L. ， & GRASSO R.J.: An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J. Immunol. Methods 123 ， 259-267 （ 1989 ） . （ 3 ） PERTICARI ， S. ， PRESANI ， G. ， & BANFI ， E.: A new flow cytometric assay for the evaluation of phagocytosis and the oxidative burst in whole blood. J. Immunol. Methods 170 ， 117-124 （ 1994 ） .
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