使用 FATIMA 方法定量分析肿瘤细胞的侵入能力

过基质的三维结构进行穿透。想完成这样的穿透，细胞要使用一些细胞表面相关和分泌因子。 FATIM （ F luorescence- A ssisted T ransmigration I nvasion and M otility A ssay ，荧光协助转移侵入和运动分析法）提供了快速定量细胞侵入的更好的办法，允许检测大量样品和不同条件下时间依赖性侵入。更重要的是，这一系统可以方便地通过在多孔膜上增加胞外基质的厚度来监测细胞侵入结构的深度。这篇应用手册例举了使用 FATIMA 法检测人肉瘤和淋巴癌细胞的侵入能力。实验步骤人的肉瘤细胞株 SK-UT-1 、 SK-LMS-1 以及 MES-SA ，加上鼠的成纤维细胞 NIH 3T3 种植到包含 10%FCS 的 DMEM 培养基中，而淋巴瘤／白血病细胞 Jurkat （ T 细胞白血病） HUT78 和 HUT102 （ T 细胞皮肤淋巴瘤）和 Raji 、 Daudi 以及 Ramos （ Burkitt 型 B 细胞白血病）放到含有 15%FCS 的 RPMI 中进行培养。孔是进行特别设计的，里面有 5 到 8um 的小孔，并加入溶解在 0.05M 的碳酸氢钠缓冲液中（ pH9.6 ）的人血浆纤维素（ FN ， Calbiochem ）、人胎盘 -10 (LN, Chemicon International) 或者是鼠尾胶原 I （ Col I, monomeric collagen type I; Collaborative Biochemical Products ）， 4 ℃ 包被过夜。其它的平板也用类似的方法在 4 ℃ 包被过夜，使用的是 Matrigel (Collaborative Biochemical Products) ，总量为 4ug 以覆盖整个的膜表面。这些过程可以产生二维的生物基质。作为对照，为了得到三维的基质，将 Col I 和 Matrigel 以 1.0 和 5.0mg ／ ml 的浓度包被到膜上，并在 37 ℃ 孵育 2 小时以得到水合胶。为了得到荧光标记，细胞使用溶解在培养基中的 5ug ／ ml 亲脂性染料 Fast-DiO (Molecular Probes, Inc) 在 37 ℃ 孵育 15 － 30 分钟。然后洗涤细胞，以 1,000,000 细胞／孔（肉瘤细胞）和 200,000 细胞／孔（淋巴细胞）进行种植。培养基为无血清的 DMEM 和 RPMI ，并在板的底层分别加上或不加上 10 － 7 M 的胰岛素 (Sigma 肉瘤细胞 ) 、来自 NIH 3T3 细胞（肉瘤细胞）的条件培养基或者是 10 ng/ml 的白细胞介素－ 1β （ IL － 1β ）。细胞迁移 24 － 48 小时后，使用酶标仪检测底部或顶部的荧光，采用多点测量模式测量 5 个点的荧光以确保均一性（顶部板的格式与标准的 96 孔板格式相同）。对应的底部板的规格与标准的 24 孔板相同，最多可以阅读 25 个类似的点。我们采用测量 5 － 25 个点的荧光总和而不是计算其平均值的方法以得到更精确的结果，因为这个值能更好地统计迁移的细胞。此外，为了知道确切地通过膜的细胞数量，例如趋化性、趋触性、侵入以及随机迁移，我们为每个反应制作了一条准确的测量曲线。为此，我们把一部分标记的细胞按一定比例稀释成浓度梯度，分别种植到 24 孔中。然后阅读荧光得到一条测量曲线，用来测量迁移的细胞的数量。这同样也可以用来评估迁移的细胞的相对的量。在本实验中，迁移的细胞的比例从 0 － 7% （与以往不同的实验设计得到的结果相同）。结果使用 FATIMA 方法检测三种不同的细胞系（肉瘤细胞来源，但和体内的迁移能力不同）在生长因子／激素诱导下侵入软组织的能力，并使用 Matrigel 作为 " 经典 " 的三维类 ECM 膜基质，以及胰岛素（模拟 IGF 样运动促进反应）和 NIH 3T3 纤维原细胞条件培养基（图 1 ，下图）。本实验清楚地表明纤维细胞条件培养基显著地促进所有三种肉瘤细胞株的迁移能力，而胰岛素则能在很大程度上消除这种运动应答。此结果与白细胞介素－ 1β （ IL － 1β ）对悬浮细胞（例如代表肿瘤细胞的肿瘤淋巴细胞）迁移能力的影响相一致（图 2 ）。在本实验中，我们使用了 T 细胞淋巴瘤 HUT102 和 Burkitt 型 B 细胞淋巴瘤 Raji. 进行了侵入两维和三维的基质比较。观察到两种细胞在基质上具有不同的迁移能力，而且对 IL － 1β （图 2 ，下图）引起的化学反应敏感。在 IL － 1β 的刺激下 HUT102 细胞能侵入 10 层的基质，而 Raji 细胞则对 IL － 1β 的存在与否并不太敏感（图 2 ）。同时也观察到了两种淋巴细胞在侵入 10 层基质和更复杂的类 ECM 基底膜 Matrigel 时也有显著的差别。（图 2 ） . 为了确定在化学物质存在与否的情况下，不同的恶性白细胞侵入两维和三维基质的能力，将 B 和 T 细胞种植包被有血清纤维结合蛋白（作为对照分子）、单层 Col I 、纤维状 Col I 、薄 Matrigel 或水合 Matrigel 基质平板上。 Jurkat 细胞在三维基质上表现出高度的侵入性（图 3 ，下图）。弱侵入性细胞则对两维和三维的侵入性上没有区别（图 3 ，下图）。共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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