上皮层羊细胞粘附程度的方法得到了大量的应用(4-6)。但是，尽管有这些最新的方法，仍有一普遍性的问题存在，那就是控制去除上层细胞时只是采用多种不同的洗涤步骤。而且当前所有已经发表的文献当中所述的方法都无法确定细胞与细胞间真实的结合力，也即细胞间相互间作用的强度。这些限制已经启迪我们对早期的一种采用的可以控制的、精确的方法去除细胞的方法进行了优化。这一方法我们在前述的文献中已经进行了描述。确定相对参数与确定细胞－基质间相互作用相比，采用CAFCA（CENTRIFUGAL ASSAY FOR FLUORESCENCE-BASED CELL ADHESION）的方法确定细胞与细胞间相互作用要求采用不同的参数设定，这一部分是由于在此过程中要涉及到两个（或者更多）类型的细胞。根据细胞生长的情况，要确定单层细胞在实验进行的时候不要存在没有被此底层细胞覆盖的区域，以避免存在非特异性结合的空间。这在检测一些能分泌大量能促进粘附的细胞外基质和相关因子的细胞时尤为重要。在这些情况下，尽可能得采用一些用多聚甲醛固定的单层细胞作为对照（或者是类似的固定过程）或者是采用已经溶解只有胞外物质留在板上的单层细胞作为对照、或者是采用一种只能允许底层细胞生长而不允许上层细胞生长的基质。例如，当要研究白细胞与人内皮细胞间的粘附作用时，我们发现Willebrand Factor也许是个不错的基质。最后，因为第一个离心步骤用于将加入的细胞与底层的单层细胞间建立连接，有可能会使细胞倾向于小孔的边缘。因此要确定单层细胞在整个的孔的生长是均一的。在采用CAFCA方法分析细胞－细胞间粘附作用时最要的变化参数是在第一和第二个离心步骤中使用的离心力的大小。在第一步中，8-12g已经足可以让细胞与底层的细胞建立联系，并避免非特异性的细胞与细胞间的相互作用。相反的，要采用超过此大小的离心力把那些未结合到分子底层的细胞或者是非特异性结合的细胞分离，以此来使细胞－细胞间的相互作用的特异性达到最大。在采用CAFCA的方法研究细胞－基质相互作用时也应采取相应的优化方法，检测细胞－细胞间离心力的优化通常来说是个经验值，依检测不同的细胞类型而不同。如果有人不得不采用较高的离心力来确保得到可重复性的结果，或者有兴趣通过不断提高离心力来确定特异的细胞－细胞间相互作用强弱的相对大小，那同样也存在使底层细胞脱离基质的风险。但是这很容易通过给底层细胞标记上不同的荧光染料（例如采用波长范围与Calcein AM 不同的CellTracker或Lypophilic染料），再使用反向离心步骤的方法来解决。使用酶标仪可以同时进行以荧光检测。最后依据细胞－细胞粘附分析目的的不同，例如想确定与细胞粘附相关的因子以及哪些因素可能会加强粘附作用，细胞－细胞相互作用的时间可能要比研究细胞－基质粘附的时间要长些。因此，通常采用在37℃孵育15-20分钟的方法，也可以延长到30-45分钟，以使可溶性的或者是细胞表面结合的粘附促进因子到达它们的活动位点。实验步骤和结果将内皮层细胞Hend 80种植到未包被的CAFCA条管上（请参阅CAFCA应用文摘I），每孔的密度为 15,000-20,000 细胞／孔 ，然后用DMEM培养基培养过夜达到的均一的程度。同样把HUVEC 细胞在实验开始前16－18小时种植到CAFCA条管中，在此实验中，为了让细胞能更好的结合到未经处理的塑料条管上（我们的实验发现这些细胞与未经处理的PVC塑料的结合能力非常差），条管已经用溶解于0.05 M碳酸氢钠缓冲液（pH为9.6）的10mg/ml的von Willebrand Factor进行了孵育。注意， HUVEC细胞要在第五代前进行实验。此外，这些细胞分别用含有和不含有10 mg/ml的LPS或10 ng/ml 的TNFα处理16小时。外周白细胞（>90% B 细胞）由慢性B细胞白血病人的肝素处理的血液当中得到，经过Ficoll梯度标准处理去除了所有的其它细胞。实验条件简单地来说，用 20 uM的Calcein AM标记白细胞，洗涤，然后按20,000-30,000-40,000 细胞/孔植入到CAFCA条管中，条管中已经包含有添加0.1% PVP和2% India ink 的RPMI培养的内皮层单层细胞。顶部和底部条管放到一起然后用46g离心HUVEC细胞以及46-710g离心Hend 80细胞。独立实验表明在此离心力下内皮层细胞与基质间没有明显的分离现象。结合淋巴细胞的比率由底部和顶部阅读方式确定，此步骤通过Tecan Genios Plus多功能酶标仪进行，并使用随机的软件进行分析。 图 1 显示了从 6 个病人得到的 B 白血病细胞与 2 个内皮层细胞即鼠内皮瘤细胞 Hend 80 以及人 TNFα 刺激的 HUVEC 结合的能力。 3 个随机选择的慢性淋巴白血病病人来源的 B 细胞与鼠内层瘤细胞的结合强度可以通过使用不断升高的离心力去除结合细胞的方法进行。 结论 使用 CAFCA （体外细胞粘附评估的荧光分析方法）来研究细胞－细胞间相互作用，具有一些比当前采用的细胞间粘附作用更好的优势，这些优势包括方法无毒性的特点、高重复性、高准确性、并有可能方便地将此方法应用于研究从健康和病人体内新鲜分离细胞间相互作用，并且是唯一有可能用于研究细胞间相互作用强度真实值大小的方法。本系统提供了一种精确分析任何类型细胞间相互作用的方法，这种细胞间作用可以发生在任何一个预先固定到 CADCA6 孔小板底部的细胞与加入到小板中的悬浮细胞间，也可以是用于研究两种细胞相互作用后与第三种细胞间的结合能力。例如，造血细胞已知可以促进连接并促进它们与内皮的连接。这种方法还提供了另一种可能性，也就是定量一种细胞与其它细胞类型的可能性。这种方法的应用可以用来研究白细胞和非细胞与内皮层的连接。最后，这种方法原则上可以用来给定细胞类型与另一种细胞或一个分子底层（定量和比较的方法，这种方法可以用来检测两种悬浮细胞彼此间与某一固定的基质间的作用。当使用不同的离心力时，研究异型的细胞结合变得更容易些（较大的离心力），只需要更换顶部的 CAFCA 的小板就可以了。相反的，与基质间有更强粘合力的细胞与 CADCA 小板的底部有更强的粘合力，要求更高的离心力才能去除掉。细胞间 CAFCA 潜在的应用可以使用不同的荧光基团进行多比较低标记。 参考文献 1) KRAKAUER, T. (1994) A sensitive ELISA for measuring the adhesion of leukocytic cells to human endothelial cells. J. Immunol. Meth. 177 , 207-213. 2) MIKI, I., ISHIHARA, N., OTOSHI, M. & KASE, H. (1993) Simple colorimetric cell-cell adhesion assay using MTT-stained luekemia cells. J. Immunol. Meth. 164 , 255-261. 3) BONGARD., CLAESSON, P.M. & CURTIS, A.S.G. (eds). (1994) Studying cell adhesion . Springer-Verlag. 4) AKESON, A.L. & WOODS, C.W. (1994) A fluorimetric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. J. Immunol. Meth . 163, 255-261. 5) DE CLERCK, L.S., BRIDTS, C.H., MERTENS, A.M., MOENS, M.M. & STEVENS, W.J. (1994) Use of fluorescent dyes for the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J. Immunol. Meth. 172, 115-124. 6) BRAUT-BUCHER, F., PICHON, J., RAT, P., ADOLPHE, M., AUBERY, M. & FONT, J. (1995) A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labelled lymphocytes. J. Immunol. Meth. 178, 41-51.
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