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ohazard Viability/Cytotoxicity kits 试剂盒提供了一种在微孔板中进行荧光检测的特殊工具。 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity 检测方法适用于动物细胞的快速分析，检测利用 Calcein AM 和 Ethidium homodimer-1 通过核染色来检测危及健康的细胞。 LIVE/DEAD Reduced Biohazard Viability/ Cytotoxicity 检测特别的设计用来减少处理病原细胞或病毒感染的细胞带来的危险，这种检测是基于细胞膜通透的绿色荧光素 SYTO 1 和细胞膜非通透的红色荧光素 DEAD Red 化合物的。 这种双核染试剂盒的主要优点在于这些试剂产生的核荧光素是固定的，这样它能在细胞内稳定数个小时。第二个优点在于这种检测方法不受被分析细胞代谢变化的影响。在这个例子中标记后的固定步骤可以被用来抑制被检测细胞中所包含的生物毒性物质。 还有一种试剂盒特别适用于必须进行长时间检测和不便于使用较短的细胞内保持时间的细胞质标记物（如 Calcein AM 和 CellTrackers ）的检测。尽管与 Calcein 相比，后一种荧光素的细胞内寿命更长，研究优先杀死高代谢活性的细胞也可以使用 Calcein 。 本例是使用绿色荧光染料 DiOC 18 和 细胞膜非渗透性的核染料 Propidium iodide 进行的细胞介导的细胞毒性实验。最后，尽管这些荧光组合看起来当做成 Kit 时更好用，但选择性的联合使用膜染料和核染料将产生更好的结果。许多不同标记的和保持时间的冻干染料（ lypophilic dye ）可以从 Molecular Probes, Inc. 公司购得， Molecular Probes, Inc. 公司也提供许多可选择的细胞膜通透的或细胞膜非通透的核染料，如 SYTO/SYTOX 系列和 Dansyl chloride 。 实验步骤 比较 Metotressato-TEVA (TEVA Pharma Italy; A.I.C./ABIC Ltd.,Israel) 对不同时期的贴壁细胞模型和悬浮细胞模型的抗癌与抗代谢的药效，用于该实验的细胞系是用作贴壁细胞模型的人平滑肌瘤细胞系 SKUT-1, SK-LMS-1 和 MES-SA 以及作为悬浮细胞模型的人类红白血病细胞系 K562 。已知这一药物在具有代谢活性的细胞的细胞周期的特定时期发生作用，引起了后来的生长吸引。平滑肌瘤细胞在添加了 10% FCS 的 DMEM 培养液中培养至长满容器，并且在实验时这些细胞用 0.1% 的胰酶分离。 K562 细胞在含有 10% FCS 的 RPMI 培养液中培养至细胞浓度为 5x10 5 个细胞 /mL. 分离并悬浮后的细胞被洗涤并重悬于不含或含有不同浓度药物的培养液中，然后以每孔约 20,000 个细胞的浓度分装到微孔板中 (Costar) 。在每孔中添加浓度为 20 mM 的 Propidium iodide (Molecular Probes, Inc.) ，然后测量培养了 0, 2, 24,32 和 48 小时的快死的细胞的荧光化合物荧光强度。在另一组实验中使用了基于荧光物质 Calcein AM 和核染料 Ethidium homodimer-1 的 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity 试剂盒 (Molecular Probes, Inc.) ，根据试剂盒的说明操作。可以使用 GENios 或 GENios Plus (TECAN 公司生产的多功能酶标仪 ) 进行检测。 结果 在 MES-SA 细胞上的对照实验确定细胞非通透性的核染料 Propidium iodide 能够在实验开始时添加到培养基中，因为它长时间稳定，并不对细胞的生存能力、代谢和繁殖产生可检测得到的影响 . 将给定细胞暴露在并不对核染料的荧光信号产生影响的阳离子和非极性的去污剂中（如 0.02% 的 CTAB 和 0.01% 的 Triton X-100 ），实验得到了 Propidium iodide 荧光强度和掺入的标准曲线。 Figure 1 显示了使用 Propidium iodide 掺入法检测的药物 Metotressato-TEVA 对两种人平滑肌瘤细胞系的时间依赖的细胞毒性作用。其中一种对药物有抗性 (SK-UT-1, 上图 ) ，而另一种受药物的强烈影响（ MES-SA, 下图） 。由于 Propidium iodide 只能穿透损伤的细胞膜，荧光密度越高反映出其受损细胞越多。这些细胞的精确数目可以由标准曲线估算出。在使用 Molecular Probes, Inc. 的 LIVE/DEAD 试剂盒的实验中，将同样的 平滑肌瘤细胞 系培养到亚静止状态，如减少他们的代谢与繁殖率。在这种条件下， Metotressato-TEVA 的细胞毒作用明显消失。 Figure 2中显示的是使用 LIVE/DEAD试剂盒的实验结果，结果显示可以检测到<3%的死亡率。由于释放到培养基中的荧光物质被洗去，高水平的Calcein AM荧光表明了高的细胞死亡率。相应的所检测到的高的Ethidium homodimer-1的荧光表明了垂死细胞的膜非通透性染色的增加。 结论在微孔板中检测细胞毒性可以提供一种快速、灵敏、方便的方法来筛选新的细胞毒物质并确定不同的细胞类型对这些物质相应的易感性。将能够区分活细胞和死细胞的荧光化合物与能够检测这些化合物所发荧光的荧光检测仪联合使用能充分改善这种检测效果。这也使大范围的、低成本的、常规化的监测成为可能。我们在此举了一个使用由荧光核染料、 Molecular Probes Inc.生产的特殊设计的荧光毒性试剂盒和 Tecan GENios 或 GENios Plus 多功能酶标仪 (TECAN)组成的系统的例子。
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