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    人外周血染色体制备

    5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。 三、操作步骤(一)细胞培养1.培养基的配制:在超净工作台中,100ml培养基含以下成分和比例:RPMI-1640 84ml小牛血清 15mlPHA 3支肝素钠 1ml卡那霉素 终浓度为100单位/ml以5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4。用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶),4℃备用。2.采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血0.3—0.5ml,立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,向10ml培养基中注入30—40滴全血,轻摇匀后置37℃恒温箱培养。3.培养:时间为68小时。培养期间,定期轻摇匀,使细胞充分接触培养基。4.秋水仙素处理:终止培养前2—4小时,在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴,使终浓度为0.07μg/ml)。 以上步骤均需无菌操作(二)染色体制备1.收集细胞:将培养物全部转入洁净离心管中,以1000rpm离心8—10分钟,弃上清液。2.低渗处理:向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml,用滴管混匀,置37℃恒温水浴中低渗15—25分钟。3.预固定:低渗后加入0.5ml固定液,轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。4.一固定:弃上清液,加入5ml固定液,轻轻混匀,静置20分钟。1000rpm离心,弃上清液。5.二固定、三固定:同一固定。6.制悬液:弃上清液后,视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。7.滴片:吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上,轻吹散,气干。8.染色:1:10 Giemsa染色5—10分钟,细水洗去多余染液,气干。9.镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。 四、注意事项l.培养温度应严格控制在37±0.5℃,培养液最适合pH为7.2—7.4。2.秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。3.低渗使红细胞膜破裂,淋巴细胞膨胀,低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻,否则引起膜破裂、染色体散失。4.离心前配平,离心速度过高,细胞团不易打散;反之,细胞易丢失。5.固定液应在使用前临时配制。6.载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。
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