植物抗虫基因工程的研究进展

理　　Bt是苏云金杆菌Baciius thuringiensis的简称，是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。通过克隆技术确定Bt基因位于30~150MD大小不同的质粒上，其中毒性区间位于该序列N端29~607个编码区，C端有高度的保守性，对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。Bt杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxic protein)，其中应用于农业生产的主要是δ内毒素。已知δ内毒素为130~160KD的多肽，在伴孢晶体内是以原毒素(protoxin)的形式存在，经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成55~70KD或更小的多肽，与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞 (brushborder membrance)上的特异受体位点结合，引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀死昆虫。1．2 Bt霉蛋白基因分类自1901年发现苏云金杆菌以来，现已分离出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字I、II、III、IV等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a，b，c等不同的基因亚型。其分类如下:cry I基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白，约30~140KD，在昆虫中肠内降解为60~70KD的多肽，在cry I基因间，氨基酸同源性为82%~90%的归为cry I A;55%~71%的归为cry I A基因中，根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为:cry I A (a)，4.50kb;cry I A (b)，5.30kb;cry I A (c)，6.60kb亚类基因。Cry II基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白，约65KD。而cry II B只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达80%左右。cry III基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体，约72KD。Cry III A基因与cry I和cryIV基因的毒性核心5 端编码区有同源性，与3端编码区有所不同，如果将3端去掉，将失去杀虫活性。Cry IV基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭园形伴孢晶体。cry IV A，135KD;cry IV B，128KD;cry IV C，78KD;cry IV D，72KD，cry IV A和cry IV B基因在结构上与cry I相似，毒性核心区段为53~78KD，位于原毒素蛋白的N端。1．3 Bt毒蛋白基因的修饰、改造及应用虽然早期的转抗虫基因植物或多或少都对昆虫有些抗性，但杀虫蛋白在植株上的表达量很低 (占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗虫效果不理想。其主要原因是目前使用的杀虫晶体蛋白大多来源于细菌，与高等植物结构基因正常的DNA序列相比，Bt基因含有较多的AT碱基和ATTTA重复序列。AT富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子，ATTTA重复序列的mRNA的稳定性差，二者都不能在高等植物中编码。此外，Bt基因中的偏爱密码子与植物中的不同，以及共中存在的一些不稳定元件如poly(A)信号序列、切割序列、终止序列等都直接影响着Bt基因在植物中的mRNA特性。为此，Monsanto公司从两条途径对原基因进行了改造。第一条途径是改进Ti质粒转化载体的启动子，加入带有SV40复制增强子区的35S启动子或重复的强化表达区 (duplicated enhanced region)，发现改建后的载体表达量比原先提高了5~10倍 (Perlak等，1990)。第二条途径是根据植物偏爱的密码子对野生型(WT)Bt基因cry I A(b)进行部分改造或人工全合成，Perlak等对WT cryIA(b)AT富含区进行点突变，改变其中63个碱基对，AT含量由63%下降至59%，而ATTTA重复序列也从13个减少至7个，部分改造后的基因称为PMcryIA(b)。PMcryIA(b)基因在转化的烟草和番茄中的表达量为1~l0ng/50ug植物可溶总蛋白，比WTcryIA(b)在转基因植物中的表达量(<1ng/50ug)提高了10倍。进一步在不改变编码的氨基酸序列的前提下，几乎更换掉WT基因中的所有不稳定元件，同时尽可能将其中的密码子换成植物优化密码子，AT含量下降至51%，去掉所有ATTTA序列。全合成的基因称为Fncry I A(b)用其转化烟草番茄，10%以上的转化植株表达量达30-100n/50ug植物可溶总蛋白，最高的可达100－150ng/50ug，比WtcryIA(b)的表达量提高50－100倍，表现较强的杀虫效果。近年来人们在Ｂt毒蛋白基因的修饰与改造、表达载体的构建、植物组织化、抗虫植物的培育等方面作了大量工作（Krattiger,1997）。我国也从1991年起开始了Ｂt cry I A杀虫基因的部分改造或全合成，并导入棉花、烟草、甘蓝等25种以上植物获得成功。目前全世界已获得50多种不同的抗虫转基因植物，技术趋向成熟，成果向商品化、实用化阶段深入，并开展大规模的田间推广试验。从1995年起，cry I A 类转基因玉米、棉花和马铃薯已商品化，性状有单基因的抗玉米螟、抗棉铃虫和抗马铃薯甲虫，还有玉米和棉花的多基因抗虫＋抗除草剂必状（表1）。表1 转Bt基因植物工程植物 Engineering plants 目的基因 Target gene 转化方法 Transformation method 参考文献 Reference 烟草 Tobacco Cry I A(a)（抗烟草天蛾） Cry I A(b)（抗烟草天蛾） Cry I A(c)（抗烟草青虫） Bt(获纯合体株系Ｄ8-14，Ｄ19-8) Cry I A(b)（切去3’端，留640序列）农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导 Barton等 1987 Vacek等 1987 田颖川等 1991 李太元等 1994 Fischhott等 1987 番茄 Tomato Cry I A(b)(抗口科鳞翅目) Bt（抗番茄果虫，番茄蠹蛾） Cry I a(b)（减少Ａ＋Ｔ含量） Bt CMV-CP 农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导 Delannay等 1989 Smith等 1990 Perlak等 1991 梁小友等 1994 马铃薯 Potato Cry III A CryIII A Cry I A(c) 农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导 Cheng等 1992 Oerlak 1993 Ebora 1994 棉花 Cotton Bt(转原生质体) Bt（下胚轴NPT II Kan’） Bt 农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导 El-Hiateny等 1990 Umbeck等 1991 Benedict等 1992 粳稻 Japonica rice Cry I A (抗稻纵叶卷螟) 电击法（原生质体） Fujimoto等 1993 水稻 Rice Bt Cry I A(b)（未见抗虫性报道） Cry I A(b) Cry I A(b) Cry I A(c) ＰＥＧ法（ＰＢＩ121）花粉管通道法基因枪法（胚性愈伤）农杆菌介导杨虹等 1989 谢道昕等 1991 许新萍等 1997 成雄鹰 1998 籼稻 Indica rice Cry I A(b) 基因枪法 Wunnj等 1996 籼稻和粳稻 Indica and Japonica rice Cry I A(b)（三化螟）基因枪法 Datta等 1998 玉米 Maize Cry I A(b) Bt、bar Bt Bt 基因枪法子房注射超声波基因枪法 Koziel等 1993 丁群星等 1993 张宏等 1993 王国英等 1993 大豆 Soybean Bt（未见杀虫效果报道） Bt 农杆菌介导（LBA4404）侵染子叶节 Parrott等 1994 徐香玲等 1997 苹果 Apple Bt 农杆菌介导程家胜等 1994 甘蔗 Sugarcane Cry I A(c)（抗非洲蔗螟）农杆菌介导 Fitch等 1996 2、蛋白酶抑制剂基因（PI基因）PI是自然界最为丰富的蛋白质之一，存在于绝大多数生物体尤其是许多植物的贮藏器官，如种子和块茎中，是一类天然的抗虫物质，与前述苏云金杆菌相比，具有抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等优点（Gatehouse,1988）。在植物界，现已发现近10个蛋白酶抑制剂家族，与抗虫基因工程关系最密切、研究最深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，基中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。因为绝大多数昆虫所利用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微。PI同昆虫消化道内的蛋白消化酶形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解作用，使昆虫厌食或消化不良致死，从而达到抗虫目的。目前已从豇豆、马铃薯、番茄、大豆、玉米等植物中分离纯化出多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA克隆。主要有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI基因）、马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（PTI基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI基因）以及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（SKTI基因）等。比较不同来源的各种蛋白酶抑制剂，发现CpTI抗虫效果较为理想，其抗虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有昆虫都有杀伤作用，而且其作用位点在酶的活性中心，突变的可能性小，昆虫产生抗性突变的可能性几乎没有，目前已应用于抗虫烟草、水稻、大豆，但由于其表达能力不够强，应用暂时受到限制。1997年高越峰、朱祯等人从未成熟的大豆子叶中分离出SKTI基因，为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶活性，尤其对鳞翅目昆虫有较强抑制作用，且SKTI对胰蛋白酶活性的抑制能力明显高于CpTI，显示出较好的应用前景。表2列出蛋白酶抑制剂基因主要应用实例。表2 转蛋白酶抑制剂基因植物工程植物 Engineering plants 目的基因 Target gene 转化方法 Transformation method 参考文献 Reference 烟草 Tobacco 水稻 Rice CpTI PTI CpTI SKTI（抗棉铃虫） CpTI（抗二化螟、三化螟） CPI（抗线虫） CPI（抗玉米象）农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导直接转化基因枪法基因枪法 Hilder等 1987 Thornburg等 1987 刘春明等 1992 高越峰等 1998 莽克强等 1993 Vain等 1994 Kentaro等 1996 3、抗虫基因工程潜在的问题、解决途径及展望伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。首先是昆虫对Bt毒蛋白产生抗性的问题。原因之一：根据Bt毒蛋白的杀虫机理，在长期选择压力下，昆虫纹缘膜细胞上的受体位点会发生改变，使晶体蛋白不能与纹缘膜细胞上的受体位点结合，失去毒杀作用，结果昆虫就产生抗生。为此，可以采取以下策略，(1)将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因;如具有广谱抗虫特点的CpTI基因以及其他多肽毒素基因结合Bt基因转化植物来抑制昆虫产生抗性。(2)采用诱导型或组织特异性表达的启动子与Bt毒蛋白基因构成嵌合基因，获得特异性表达的抗虫品种。使Bt基因只在害虫侵害时或者只在植物易受害虫侵害的部位或者只在一定的条件下 (如化学调节剂)高效表达，以减少耐受性昆虫的发展。(3)把高剂量表达的转基因植物与非转基因植物混合播种，使在Bt植株上具有纯合抗性基因的抗性昆虫与非转基因植物内易感昆虫交配，它们的后代成为杂合体，这样可以去除昆虫产生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆虫群体中固定。原因之二：Bt毒蛋白的抗虫谱较窄，某一特定的毒蛋白只对某一种或几种害虫具有毒杀作用，害虫易对其产生抗性。对此可同时使用两个以上的Bt毒蛋白基因转化植物。不同的Bt毒蛋白，根据与竺定昆虫中肠纹缘膜细胞不同受体位点的结合程度，分为竞争性结合 (competitively binding)和非竞争性结合 (noncompetitively binding)蛋白，如果两种晶体蛋白竞争结合昆虫中肠全部受体位点，就称为竞争性结合毒蛋白;如果与第一种毒蛋白结合的受体中有一个或多个不为第二种蛋白所竞争，反之亦然，那么，对该昆虫来说，这两上毒蛋白都是非竞争的。将编码非竞争性结合毒蛋白的2个或2个以上基因同时导入植物，能在很大程度上延缓害虫所产生的抗性。第二个问题是目前Bt毒蛋白基因在转基因植物体中的表达水平普遍较低，存在基因“沉默”和甲基化现象，不能有效地毒杀害虫。基因沉默与目的基因在受体植物中的甲基化状况、拷贝数、插入受体染色体位点及是否与受体植物中有同源基因等因素有关。目前主要采取以下措施来克服基因沉默现象；(1)避免多拷贝外源基因整合到受体基因组中，如利用Ac/Ds转化载体、双元细菌人造染色体载体、构建核基质支架附着区载体系统。(2)用具有特殊功能的启动子与增强子调控。(3)在有性世代后代中筛选单拷贝转基因个体。（4）继续深入研究DNA的空间结构以及各种调控因子和环境因子对转基因的影响。Jaquet等分析至少有三种因素影响杀虫活性:毒素的来源、晶体的溶解性和昆虫对毒素的内在敏感性，昆虫对毒素的内在敏感性至少还与中肠液pH、蛋白酶活性和毒素受体的类型、数量有关。Bt毒蛋白有134个亚类，它们一级结构的差异以及昆虫中肠上皮细胞上的受体是影响杀虫晶体蛋白毒力和杀虫特异性的两个重要因素。随着转基因沉默机理研究的不断深入，这种现象最终必将会得到克服。抗虫植物基因工程是一项应用性极强的研究，它使短时间内培育出抗虫品种成为可能。同时正在进行田间试验的性状中，多基因抗虫性状也屡次出现，将Bt基因、特殊的抗病基因、抗除草剂基因及优良品质基因集聚于同一品种。相信不久的将来，会有越来越多的多基因抗虫品种问世。
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