单克隆抗体技术：细胞融合

用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。(8) 40孔塑料培养盘。2．操作方法⑴ 准备好脾细胞。⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。⑶ 室温400g离心3min，使细胞沉淀。⑷ 移去上清液。⑸ 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。⑹ 加预热至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。⑺ 加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。⑻重复⑺一次。⑼ 加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。⑽ 重复⑼一次。⑾ 加1640液15ml。⑿ 室温，400g离心1min，使细胞沉淀。⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。⒂ 轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10黃－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。细胞融合的关键1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
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